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直接免疫荧光法的注意事项

 直接免疫荧光法的注意事项

•  对荧光标记的抗体的稀释:要保证抗体的蛋白有一定的浓度;

•  一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。

•  染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化;

–  染色时间:从10 min到数小时,一般30 min

–  染色温度:多采用室温(25°C),高于37°C可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2°C的低温,延长染色时间。

–  低温染色过夜较37 °C 30 min效果好的多。

•  试验时需设置下列对照:

–  自发荧光对照(空白对照):标本加0.01mol/LpH7.4PBS代替一抗。

–  阳性对照:用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。

–  特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。

•  若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。

•  一般标本在高压汞灯下照射超过3min,就有荧光减弱现象;

•  经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。

2 间接法又称为荧光抗-抗体法

 需要两种抗体参与,即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用,但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。

–  可用来检测标本中未知抗原,也可检测血清中未知抗体。

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