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透射电镜超薄切片和染色实验
实验方法原理
实验步骤
1. 取材 对一般的动物组织取材的要求如下:

(1) 标本材料要新鲜,取材速度要快:由于生物组织离体后,细胞将会立即释放出各种水解酶而引起细胞自溶,使其微细结构发生改变而产生假象,故要尽量保持材料的新鲜,经解剖、手术或活检取材后迅速投入固定液内,以尽量保持细胞在活体状态的结构。

(2) 取材小,取材部位要准确:由于用于电镜标本制备的固定液其渗透速度极慢,同时超薄切片的面积又很小,一般取材不超过 0.5-1mm3, 故取材时必须注意取材部位。如取材部位不当,则无法获得预期的结果。

(3) 所用的固定液及器材都必须预冷,以尽可能降低离体细胞内水解酶的活性,减少细胞自溶,一般均将固定液保存于 4℃冰箱内,取材用的剪刀或手术刀片及载玻片可置于冰块上预冷。

(4) 切割组织的刀、剪必须很锋利,操作时避免拉、扯、锯、压等动作所造成的机械损伤。如果标本是病毒的分离培养物,则必须注意其数量、浓度。这种培养物取材后可用塑料离心管离心取其沉淀物,其量在离心沉淀后必须有米粒大小,如量太少,则无法进行以后的操作。取材的具体方法:根据所取的标本数量准备好洁净的小瓶(瓶子必须经过严格的洗涤),在每只瓶上贴好标签或编号,瓶内注入 4℃固定液 1-2ml。另外准备好洁净的载波片及手术刀片及少量冰块,将载波片置于冰块上。组织离体后立即置于载波片上,并滴上几滴 4℃的固定液,再用锋利的刀片将组织切成 0.5~1 mm3的小块,并立即投入到固定液中置于 4℃ 冰箱中固定。

2. 固定

(1) 固定方法:固定方法有物理的和化学的两种。前者系采用冰冻、微波照射、临界点干燥等手段来保存细胞结构;后者是用一定的化学试剂来固定细胞的结构,这些化学试剂称固定剂,它能与蛋白质发生化学结合形成交联,从而稳定细胞内的蛋白质,并能使脂肪、糖类保持生活时的状态和位置,将精细的形态结构保存下来。组织通常多采用化学方法固定。理想的固定剂应具备如下条件:①能迅速而均匀地渗人细胞内部,立即杀死细胞以尽量减少「死后变化;②能稳定各种结构成分,以保证在后续的各种处理过程中不致溶解或流失;③能保存细胞的酶活力和抗原性,以供细胞化学或免疫细胞化学的测定母)不影响细胞的收缩或膨胀,以保持各种结构处于生活时的状态;④不出现人工假象或变形,以保证电镜图像的真实性。为了达到上述要求,还必须重视固定液的 pH 值、渗透压及电解质浓度等。

3. 染色 具体染色方法:由于铀和铅具有不同的电子染色作用,故目前切片普遍都采用双重染色法,即先用轴染色后,再用铅染液染色。具体操作步骤:在干净的培养皿内放置蜡板或经熔化的石蜡浸过的滤纸,将醋酸铀染液滴在蜡板或用浸过的滤纸上,将捞有切片的载网覆于染液上(切片面接触染液)染 15~30 min, 用双蒸水冲洗切片、用滤纸吸干、再将载网覆于拧檬酸铅染液上(为防止碳酸铅沉淀的形成,可在培养皿内放入几粒固体氢氧化钠),染 5~10 min, 用双蒸水冲洗切片,吸干,放入洁净的培养皿内备用,电镜检查。

注意事项
取材的正确与否将与所制备的标本能否符合观察要求密切相关,是超薄切片技术中的关键环节。

固定目的:①尽肤保持细胞的结构在活体状态;②在固定以后的漂洗、脱水和包埋时,保持细胞成份不致流失和溶解,并使组织适当的硬化,使组织细胞内各种物质的化学反应改变最小;③为标本以后的处理过程(包括染色和经受电子束轰击)作准备。

几种常用固定剂:1) 锇酸(Osmium tetroxide,OsO4锇酸即四氧化锇,是淡黄色块状或针状结晶,熔点 40~41℃, 分子量 254.2, 溶于水、酒精、乙醚及氯仿。它的蒸汽有强烈刺激性,对人眼、鼻、喉粘膜有毒性作用,操作时应注意防护,最好在通风柜内操作。锇酸为强氧化剂,对氮具有极大的亲和力,能与蛋白质形成交联,稳定蛋白质的各种结构成份而不产生沉淀。它对脂类有良好的保护作用,能与不饱和脂肪酸链结合,形成复合物,是唯一能固定脂类的固定剂。此外,高密度的金属饿与被固定的组织成分结合,受到电子束照射时能散射大量电子,使图像反差增大,起到“电子染色”的作用。锇酸固定可避免组织块收缩或膨胀,使组织块软硬适度,利于制作超薄切片。锇酸的主要缺点是分子较大,对组织的渗透速度缓慢 (0.1~0. 3mm/h) 易产生固定不均匀,因此要求组织块体积不超过 1mm3 。锇酸对碳水化合物类固定效果不佳,使酶活性丧失较多,也会破坏抗原性,因此不宜用于酶细胞化学和免疫细胞化学研究。锇酸固定液的浓度为1%, 固定时间为1~4h比如固定单层培养细胞则为 15~30 min 。

2) 戊二醛(Glutaraldehyde,C5H8O2): 分子量为 100. 12 。沸点 73~75℃, 吸收光谱为280nm 。市售戊二醛为 25% 或 50% 的水溶液,其 pH 为 4.0~5.0 。多采用电镜专用的精制戊二醛,长期贮存的戊二醛可因高温、氧气、中性或碱性 pH 发生聚合而失去醛基,固定效力也明显降低,故戊二醛原液应保存于低温处。已配制的戊二醛于 4℃保存。应尽量使用新鲜配制的戊二醛固定液。戊二醛对组织渗透力强,固定速度快 (0.4mm/h) 对细胞内结构有活跃的亲和力,特别是对细胞内某些易变的结构,如微管、有丝分裂的纺锤丝以及细胞基质有较好的固定作用,它和蛋白质及氨基酸的反应是在溶液中通过与组织和蛋白质发生交联作用,而使细胞成分得以稳定。它能保存糖元,固定核蛋白,能保存酶的活性,适用于细胞化学研究。戊二醛的另一优点是,被戊二醛固定的组织块可在固定液中保存较长时间(数周甚至 1~2 个月)而不致有任何超微结构的改变这尤其适宜于远距离以外临床、实验室或野外现场的取材保存。但戊二醛也非理想的固定剂,它不能保存脂肪,无电子染色作用,不能增加图像反差,且对缓冲液渗透压要求较高。目前固定大多采用戊二醛与锇酸双固定法,戊二醛作预固定,锇酸作后固定,互相取长补短,固定效果较好。经戊二醛固定的组织须用缓冲液反复漂洗,否则残留的戊二醛会影响锇酸的渗透固定。戊二酸固定液的浓度微 1%~5%, 固定时间为 0.5~2 h 。

目前,电镜常用的超薄切片染色剂是铀盐和铅盐。铀可与大多数细胞成分结合,特别易与核酸结合,而且染色较细致、真实、不易出现沉淀颗粒,但铀具有放射性,使用时要特别注意。铅对细胞和组织各种结构都有亲和力,易与蛋白质结合,尤其是对不能被四氧化锇染色的糖原具有染色作用。但铅染色比较麻烦,铅易和空气中的 CO2 结合形成不溶性的碳酸铅沉淀,污染切片。因此,在染色时要尽量避免染色与空气中的 CO2 接触。一般是在加盖的染色平皿内放置一些 NaOH, 以减少铅与空气中二氧化碳的接触。
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