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原位杂交实验所用探针
杂交实验所选择的核酸探针可以分为两种:克隆 的或合成的。实验中,应根据不同的杂交实验选择相应的核酸探针。一般来说,可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。特别是当存在特异的克隆,或当DNA序列未知而又必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时,常常选用克隆探针。

RNA探针也是一类很有前途的核酸探针,由于RNA是单链分子,所以它与靶核酸序列的杂交反应效率极高。克隆探针一般比寡核苷酸 探针的特异性强,复杂性也高,并可获得强的杂交信号。合成的寡核苷酸探针具有一些独特的优点:
①由于链短,其序列复杂度低,相对分子质量 小,所以,和等量靶位完全杂交的时间较克隆探针短;
②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化,因此短探针中碱基的错配能大大降低杂交体的Tm值;
③可大量合成,价格廉价。

在分子杂交技术的发展早期,较多使用放射性同位素如32P、35S等来标记核酸探针,在相当一段时间内,放射性同位素被视为探针的传统标记物且发挥着重要作用,它有十分明显的优点如灵敏度高、特异性高以及方法成熟简便。但随着分子杂交技术的发展,它的缺陷也越发突出:半衰期短,必须经常标记探针:如32P半衰期只有14.2天,放射强度逐渐衰减。35S的半衰期可达88天,但衰变能量只有32P的1/10,灵敏度较低,只能用于多拷贝基因的检测。3H的半衰期虽长达12.3年,但衰变能低,灵敏度太低。费用高:需要用进口试剂,价格高。检测时间长:用放射自显影需要较长的暴光时间。放射性同位素对人体有害,实验室和环境容易被污染,放射性废物处理困难。因此,推广使用受到限制。

鉴于放射性标记探针在使用中的局限,促使非放射性标记核酸探针得以迅速发展,现在许多领域已用非放射性标记核酸探针取代放射性标记核酸探针,从而推动了分子杂交技术的发展和广泛应用。目前,非放射性标记法可以分为两大类:一类为酶促标记法,另一类为化学标记法。酶促标记法常可更好地修饰DNA,以产生比非酶促法高的敏感性。其缺点是复杂、产量低、成本高,难以大规模推广。

相比之下,化学标记法便宜而简单,有些化学系统可将不同的检测基因用相同的化学方法连接到DNA分子上。非放射性RNA探针很少用,因为大多数标记只适合于DNA探针。另外,RNA探针与DNA探针相比没有明显的优越性,而在标记、杂交和检测过程中为了避免RNA降解还需要极为小心。

目前,应用最为多的非放射性标记物有三种:生物素、地高辛和荧光素。第一个被实际运用设计的非放射性标记DNA探针是生物素。这种早期探针的标记方法是通过酶促聚合作用将生物素标记的脱氧三磷酸核苷酸掺入到DNA中。杂交后,可以利用抗生物素蛋白或链菌抗生素蛋白-酶结合来检测这些生物素标记的探针。

地高辛标记探针已有商品化试剂盒。地高辛作为一种半抗原,其修饰核苷酸的方式与生物素相似,也是通过一个连接臂将地高辛半抗原和核苷酸分子相连。标记的核苷酸可利用一种单一碱性磷酸酶联抗体,经30~60 min温浴即可达到与生物素标记探针相同的灵敏度,甚至更高。当要检测内源性生物素比较高的组织如肠胃系统时,如果用生物素标记的探针进行杂交,其杂交信号将受到非特异性信号(内源生物素)的干扰,使其特异性降低。因此,目前地高辛的应用比生物素更广泛。

荧光素标记核酸探针也有商品化试剂盒,其敏感性与地高辛和生物素相似。特别是在近期,随着染色体荧光原位杂交技术的迅猛发展,使得荧光素标记探针的开发和发展也有了突飞猛进的进步。

                                                                                                                               本文来自丁香园

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