细胞凋亡（apoptosis）又称细胞程序性死亡，不仅在生物生理过程中起关键作用，还与许多疾病的发生发展关系密切，对异常细胞凋亡进行调控具有巨大的医疗潜力。随着对细胞凋亡研究的深入，许多凋亡过程的形态学、生物化学、基因学等机制逐渐被阐明。形态学检查、流式细胞术等体外检测技术较为成熟且应用广泛，但均属有创非实时检查。分子影像技术为无创在体实时检测细胞凋亡提供了有效工具，其中放射性核素凋亡显像是借助放射性显像剂与凋亡细胞特异性靶点的结合来实现的，具有高灵敏度、高特异性的特点，是研究最早、最成熟的体内凋亡检测技术。已经有许多针对凋亡细胞不同靶点的放射性探针被开发并进行了生物学评价，多种具备临床转化潜力的探针已应用于临床研究。本文介绍凋亡的发生机制、变化特征和特异靶点，综述用于放射性核素凋亡显像的相关探针。
一、细胞凋亡的特征
细胞接受凋亡信号后，通过外源性途径或内源性途径激活执行凋亡的关键酶和蛋白。在凋亡早期，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）由膜内层迁移至膜外层，此时细胞质密度增加，线粒体结构大体完整，但膜电位消失，通透性改变。一系列的信号传导激活了含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase 3），Caspase 3的裂解作用导致DNA降解、细胞骨架降解、核蛋白降解等变化，最终细胞裂解成凋亡小体被吞噬细胞清除。细胞凋亡和细胞坏死不仅机制不同，形态学、生化改变等也有显著差异，这为在体检测凋亡并区分坏死细胞提供了靶点，利用特异结合靶点的核素探针可以进行体内凋亡显像。
二、蛋白质及多肽类探针
1．针对PS靶点探针。
膜联蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）是一种重组PS结合蛋白，可与PS特异性结合。99Tcm-HYNIC-Annexin Ⅴ是临床研究最深入的Annexin Ⅴ类凋亡探针，该药在正常人血液清除半衰期为24 min，主要经肾代谢，但肝、脾、骨髓摄取均较高，并且生物半衰期为69 min；在治疗3 d后，疗效显著的不同类型肿瘤患者（如淋巴癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌）比无效者的肿瘤摄取值显著增加，表明该探针可以用于肿瘤早期疗效评价。此外，巯乙酰三甘氨酸（mercaptoacetyltriglycine，MAG3）、双半胱氨酸（ethylenedicysteine，EC）等多种螯合剂可连接99Tcm和Annexin Ⅴ，但并未发现这些探针更具优势。利用位点特异性标记法得到的99Tcm-Annexin Ⅴ-128具有更高的灵敏度和特异性，Ⅰ期和Ⅱ期临床试验表明其检测凋亡的能力是99Tcm-HYNIC-Annexin Ⅴ的2倍，并且肾脏摄取值降低75%。尽管Annexin Ⅴ类探针体外研究结果非常理想，但其相对分子质量偏大，体内药代动力学不理想，腹部信噪比低，且无法区分坏死和凋亡。Meta分析结果显示，99Tcm-Annexin Ⅴ类探针具有较高的阳性预测值及较低的阴性预测值，这些缺点使其难以成为临床理想的凋亡探针。
2．针对PE靶点探针。
细胞凋亡早期的另一生化改变是PE外翻，耐久霉素（Duramycin）是一个含有19个氨基酸的多肽，能高亲和力、高特异性地与PE以1∶1比例结合。研究显示，诱导凋亡组细胞对99Tcm-HYNIC-Duramycin的摄取比对照组高30倍，该标记化合物主要经肾代谢、血液清除快、肝和肠胃摄取低、心肌凋亡细胞摄取快。较高的腹部图像信噪比及简便的标记方法使99Tcm-HYNIC-Duramycin受到关注，该探针在不同疾病动物模型上均显示出良好的凋亡细胞结合能力。
3．针对Caspase 3靶点探针。
Caspase 3为凋亡的关键执行分子，在早期阶段被激活，但细胞凋亡晚期或死亡时Caspase 3的活性明显下降。因此，检测Caspase 3活性可以用于凋亡早期评价。天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸（Asp-Glu-Val-Asp, DEVD）是Caspase 3的作用底物，能够特异地被Caspase 3裂解而滞留于凋亡细胞中，Doss等合成了含DEVD链的多肽18F-CP-18，健康人PET显像结果表明18F-CP-18通过肾脏迅速排泄至膀胱；张宝石等的动物实验表明18F-CP-18比18F-FDG能够更早、更准确地反映肿瘤对化疗的反应；阿霉素诱导心肌毒性的小鼠模型对18F-CP-18的摄取值增长与心肌细胞Caspase 3表达的增长呈正相关。但该探针必须先进入细胞才能被Caspase 3裂解并滞留，而肽的分子结构决定其无法通过自由弥散的方式进入细胞，体外放射自显影的研究结果显示，肿瘤细胞的18F-CP-18摄取值和Caspase 3表达程度的相关系数较低。
Shen等设计了一种新型凋亡探针18F-Caspase 3敏感性纳米聚合体示踪剂（Caspase 3 sensitive nano-aggregation tracer, CSNAT），进入细胞后经DEVD链切除、残基还原和分子内环化反应生成cyclic-18F-CSNAT，因具有强疏水性可原位自组装成高比活度的纳米聚合物，不易被细胞排出，注射后凋亡细胞摄取值随时间延长增加，有利于增强PET显像的对比度；荷瘤鼠化疗后18F-CSNAT的肿瘤摄取、浓聚结合速率常数和肿瘤/肌肉摄取比值均显著升高；该课题组还比较了18F-CSNAT、18F-FDG和99Tcm-Annexin Ⅴ在同种凋亡细胞中的摄取值和荷瘤鼠的PET显像图，结果显示细胞化疗后18F-CSNAT摄取值提高了2.1倍，高于99Tcm-Annexin Ⅴ，而18F-FDG和2-（5-[18F]氟-戊基）-2-甲基丙二酸{2-（5-[18F]fluoro-pentyl）-2-methyl-malonic acid，18F-ML-10}无明显变化，但18F-CSNAT存在腹部脏器摄取值高的缺点。
三、小分子类探针
与大分子探针相比，小分子凋亡探针除具有标记成本低、效率高的特点外，还有血液清除快、非靶器官摄取低、靶组织灌注速率快等药代动力学特征，更具临床转化潜力。
1．针对PS靶点探针。
Zn2＋-二（2，2′-二吡啶甲基胺）[Zn2＋-bis（2，2′-dipicolylamine），Zn2＋-DPA]类配合物为Zn2＋依赖型PS特异结合小分子化合物。以18F-对氟苯甲醛（18F-fluorobenzoate, 18F-SFB）为前体可得到85%的标记产率，动物实验表明该化合物比99Tcm-Annexin Ⅴ靶灌注速率更高，荷瘤鼠化疗后，肿瘤部位18F-FB-DPA摄取明显增加，同时18F-FDG摄取并未升高；另一项研究以4-硝基苯-2-[18F]氟丙酸酯{4-nitrophenyl-2-[18F]fluoropropionate，18F-NFP}连接Zn2＋-DPA得到18F-FP-DPA探测急性梗死的心肌细胞，注射后60 min模型组心肌摄取值为对照组的1.8倍，心脏/肌肉摄取比为3.24，但肝、肾、肺、脾、肠、骨等组织摄取均较高，图像信噪比很差。Wyffels等分别利用[99Tcm （CO）3]＋和99Tcm-HYNIC连接DPA，肝损伤小鼠模型显示凋亡肝细胞摄取99Tcm-HYNIC-DPA是正常肝细胞的2.2倍。尽管放射性核素标记的DPA在活体凋亡显像和放化疗疗效评价方面有一定潜力，但该类化合物体内通过肝和肾脏代谢，且其余组织弥漫分布放射性，较低的T/NT比值降低了图像的对比度；此外，无法区分凋亡、坏死及炎性病变也是该探针的不足之处。
2．针对Caspase 3靶点探针。
据相关报道，靛红磺胺类化合物可选择性抑制Caspase 3，体外半抑制浓度为纳摩尔级别。1-4-（2-[11C]甲氧苄基）-5-（2-苯氧基甲基-氮杂戊环-1-磺酰基）-1H-吲哚-2，3-二酮{1-4-（2-[11C]methoxybenzyl）-5-（2-phenoxymethylpyrrolidine-1-sulfonyl）-1H-indole-2，3-dione，11C-WC-98}是唯一见于报道的11C标记靛红磺胺类探针，microPET显像显示，11C-WC-98能特异性地浓聚于Fas抗体介导的肝细胞凋亡小鼠模型损伤的肝脏，但半衰期太短及生物学分布特性差于同类18F标记化合物限制了其应用；（S）-1-{[1-（2-[18F]氟乙基）-1H-4-[1，2，3]三唑基]甲基}-5-（2，4-二氟苯氧甲基-吡咯烷-1-磺酰基）靛红{（S）-1-（（1-（2-[18F]fluoroethyl）-1H-[1，2，3]-triazol-4-yl） methyl）-5-（2-4-difluorophenoxymethyl-pyrrolidine-1-sulfonyl）isatin，18F-ICMT-11}因其良好的生物学性质受到关注。
18F-ICMT-11的合成符合GMP标准，比活度高达（685±237） GBq/μmol。健康志愿者的PET显像显示，18F-ICMT-11注射后迅速由肝脏和肾脏摄取并代谢，约3 h后逐步清除，而30 min后胆囊和肠道摄取逐渐增加，人体全身照射有效剂量仅为（0.025±0.004） mSv/MBq; 18F-WC-4-116作为第2代靛红磺胺类凋亡探针，与18F-ICMT-11一样，均具有很快的体内代谢速度，腹部脏器摄取少，可得到良好的图像对比度，也均可探测心肌缺血损伤和肿瘤对治疗的反应。但研究表明，无论是对体外分离纯化的Caspase 3，还是对完整细胞乃至生物活体，靛红磺胺类抑制剂对Caspase 3的亲和力均明显下降，这可能与抑制剂在细胞内或活体内发生非特异性化学反应有关，例如靛红类分子的二羰基也能共价结合其他半胱氨酸蛋白水解酶类，如组织蛋白酶等。
3．细胞膜印迹类探针。
凋亡细胞的膜印迹改变包括细胞膜电位丧失、胞液酸化、脂质移行酶系统激活等。以色列ApoSense公司依据这些改变开发了一系列亲水亲脂小分子化合物作为细胞膜印迹显像剂，其无法通过活细胞完整的质膜，却能选择性地通过凋亡细胞膜并早期聚积在胞质内，由此区分凋亡细胞和坏死细胞。18F-ML-10以丙二酸为核心结构，是第1个应用于临床研究的小分子凋亡探针，主要应用于早期评价脑部肿瘤的放疗疗效。此外，18F-ML-10在鼻咽癌放疗疗效评价、动脉斑块诊断等方面也有应用潜力，但在大鼠脑卒中模型、PC-9和A549非小细胞肺癌细胞化疗前后、EL-4淋巴瘤细胞化疗前后、Burkitt淋巴癌裸鼠放化疗前后靶组织，18F-ML-10摄取无明显区别。
4．针对线粒体膜电势类探针。
正常细胞的线粒体跨膜负电位维持在较高水平，使亲脂阳离子能够通过线粒体膜聚积其中，而细胞凋亡早期，在PS外翻之前，线粒体跨膜电位下降与Caspase活化同时发生，因此细胞内线粒体膜电位下降可作为凋亡检测的靶点。18F-氟苯基三苯基膦（18F-fluorobenzyl triphenyl phosphonium，18F-FBnTP）是一种对电位敏感的阳离子化合物，其细胞摄取量依赖于细胞膜电势，线粒体的功能障碍时细胞摄取值反而降低。实验证实，紫杉醇诱导前列腺癌细胞凋亡后，18F-FBnTP摄取值降低了52.4%，而18F-FDG的摄取值仅下降12%，化疗后的肺癌细胞、乳腺癌细胞对18F-FBnTP的放射性摄取也明显减低。但该类显像剂在体内经肾和肝代谢，心肌、胆囊、胃壁、小肠、脾、结肠、直肠和睾丸均有摄取，以心肌摄取最高，血液清除很快，因此更适合用于心肌梗死的检测；当其应用于凋亡检测时，需要将细胞凋亡前摄取值作为基线，这样才能根据凋亡后摄取值下降程度推断细胞是否处于凋亡早期，并且随着细胞凋亡的进展，线粒体内摄取迅速减少，信号也随之减少。因此，该显像剂只有当应用于心肌、肾脏这类线粒体分布密度高的器官时，才能获得较好的效果；而在低代谢器官，其使用受限，这主要是因为该类器官的基线水平较低，无法显示凋亡后摄取值的下降。
四、总结与展望
从细胞接收凋亡信号到凋亡小体形成，期间出现了许多特征性变化（如PS和PE外翻、Caspase活化、线粒体膜去极化等），设计能特异结合不同靶点的化合物，并标记上放射性核素，可得到相应的凋亡显像剂。
蛋白质类凋亡探针最早被用于凋亡显像，但其相对分子质量大，难以穿透细胞膜，通常以细胞膜外翻的PS或PE为靶点，因此特异性较差，无法区分凋亡与坏死；同时，该类探针的血液清除慢、腹部脏器生理摄取高、图像信噪比低等缺点，使其难以进入临床应用。相比较而言，多肽类探针的相对分子质量较小，血液清除快，图像信噪比高，但目前仅有动物实验报道，应进一步开展临床试验以验证其转化潜力。18F-CP-18的特异性和灵敏度较高、非靶器官清除快、临床使用安全，但其必须通过细胞膜才能被Caspase 3裂解，如何改变结构以改善其进入细胞的量是今后的研究方向。小分子类探针是目前主要研究的凋亡显像剂，也最有希望常规应用于临床，其中靛红磺胺类显像剂18F-ICMT-11和细胞膜印迹显像剂18F-ML-10均已进入临床研究阶段。18F-ML-10在脑肿瘤的放疗疗效早期评价方面已展现出价值，但该方法需比较放疗前后2次PET显像结果才能得出结论，且在多种常见肿瘤细胞诱导凋亡实验中18F-ML-10并未表现出探测凋亡的能力，因此有必要加以更深入的研究。
凋亡探针仍未大规模应用于临床的主要原因为：（1）标记纯化成本高；（2）无法区分坏死和凋亡细胞；（3）结合机制不明确；（4）腹部本底摄取值高；（5）肿瘤放化疗疗效评价需术前和术后各进行1次凋亡显像，有时还需借助18F-FDG等多种探针的显像结果共同评价，造成患者的重复检查。具备临床转化潜力的凋亡显像探针应具备以下特点：（1）探针合成简便，成本可控；（2）机制明确，特异性和亲和力高；（3）非靶器官清除快，T/NT比值高；（4）临床应用简便，评价手段可靠。
综上，小分子类凋亡显像剂仍是今后研究的热点，除了对已开发探针做进一步的研究外，计算机辅助设计和分子对接软件的应用使新型化合物的大通量筛选成为可能，分子生物学和细胞生物学的发展使放射性探针的评价更加迅速和精确，合成方法的改良和创新使药物的制备更符合临床应用标准。相信在多学科的共同推进下，凋亡显像剂的基础研究和临床转化必将得到迅速发展。
来源：中华核医学与分子影像杂志2017年第37卷第6期
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