实验操作步骤
第1和第2天
细胞交联
➤ 小鼠T细胞从培养板转移到50 mL离心管,4°C条件下271 g离心5 min,用30 mL IMDM细胞培养基重悬细胞颗粒,用Neubauer室计数细胞。
➤ 收集20×106细胞到新的50 mL管中。
➤ 直接在细胞培养基中添加甲醛(FMA),使终浓度为1%,室温培养10 min。注意:吸入FMA是有毒的,所以工作时穿上适当的防护设备。另外,请按废液处理标准处理FMA废液。
➤ 添加1/8体积的1 M甘氨酸,pH为7,室温下孵育5 min。
➤ 4°C条件下271 g离心5 min收集细胞,再用10 mL PBS冲洗。
➤ 用1 mL PBS冲洗细胞颗粒,移液至1.5 mL管中。
细胞溶解与染色质破碎
➤ 用1 mL SDS裂解缓冲液悬浮细胞颗粒,冰上孵育10 min。
➤ 每个样品用超声破碎:VCX750,25%功率,4.5 s冲击,9 s间隙。共14次。
➤ 剪切后,将样品移到1.5 mL离心管中,4°C条件下18000 g离心10 min。
➤ 将上清液转移到新的离心管中。
➤ 先用50 µL按照步骤三检测破碎效率,其他的超声破碎产物分装后在液氮中快速冷冻置于-80°C保存。
破碎效率的测定
➤ 50 µL超声破碎产物中加50µL洗脱缓冲液,65°C过夜摇动孵育。
➤ 添加100 µL TE缓冲液和4 µL 10 mg/mL RNase A(0.2 µg/µL终浓度)。混匀后37°C摇动孵育2 h。
➤ 添加2 µL 20 mg/mL蛋白酶K(0.2 µg/µL终浓度),混匀后55°C摇动孵育2 h。
➤ 将每个样品转移到适合于苯酚/氯仿/异戊醇萃取的凝胶管中,按照制造商的指示处理。
➤ 添加200 µL的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),摇匀。24°C条件下16000 g离心5 min,上清转移到新的管中。注意:酚、氯仿和异戊醇有腐蚀性,请在通风橱下操作,并穿戴适当的防护设备。此外,请按废液处理标准处理废液。重复一次本步骤。
➤ 使用纯化柱纯化DNA,根据说明书进行操作。
➤ 测量DNA的浓度。
➤ 在1.8%琼脂糖凝胶上分析大约500 ng的纯化DNA。注意:DNA片段的预期大小介于200到500 bp之间。
第3和第4天
免疫共沉淀
➤ 用5倍体积稀释缓冲液稀释超声破碎产物。
➤ 加30 µL/mL protein A agarose beads在寒冷的房间里旋转30 min。
➤ 4°C条件下750 g离心5 min。
➤ 收集10%作为input储存在4°C。
➤ 其他产物中添加所需抗体(详见下表),并在4°C旋转过夜。
➤ 添加40 µL protein A beads,在4°C旋转孵育1 h。
➤ 分别用1 mL低盐缓冲液、高盐缓冲液、LiCl缓冲液、TE缓冲液洗沉淀复合物。清洗步骤:加入溶液,在4°C旋转孵育10 min,4°C条件下950 g离心3 min,除去上清。
➤ 添加110 µL洗脱缓冲液,室温孵育15 min,每2 min搅拌一次。
➤ 4°C条件下950 g离心3 min,100 µL上清液转移到一个新的1.5 mL管中。
➤ 按照7-8的步骤,用100 µL洗脱缓冲液与洗脱物结合。在input样本中加入200 µL洗脱液。
➤ 将所有的样品在65°C摇动过夜。
第5天
DNA纯化
➤ 添加200 µL TE缓冲液和8µL 10 mg/mL RNase A(0.2 µg/µL终浓度),混匀后在37°C摇动孵育2 h。
➤ 添加4 µL 20 mg/mL蛋白酶K(0.2 µg/µL终浓度),在55°C摇动孵育2 h。
➤ 将每个样品转移到适合于苯酚/氯仿/异戊醇萃取的凝胶管中,按照制造商的指示处理。
➤ 添加400 µL的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),摇匀。24°C条件下16000 g离心5 min,上清转移到新的管中。注意:酚、氯仿和异戊醇有腐蚀性,请在通风橱下操作,并穿戴适当的防护设备。此外,请按废液处理标准处理废液。
重复一次本步骤。
➤ 使用纯化柱纯化DNA,根据说明书进行操作。最终溶于50µL去离子水中。
图1、CHIP实验的原理和步骤图示
图2、成年小鼠T细胞系破碎效率的检测
(A)成熟小鼠T细胞系E2-10HA的破碎效果,大约500 ng纯化的DNA在1.8%的琼脂糖凝胶进行破碎效率的分析。
(B)用电泳法对样品1和2的纯化DNA进行分析,评价其破碎质量。
图3、增强剂和促进剂的染色质标记
表 /实验中用到的试剂配方
参考文献:Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines.J Vis Exp. 2017 Jun 17;(124). DOI: 10.3791/55907.
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