我要啦免费统计
当前位置 :主页 > 基金课题 > 科研心得 >
实验专栏丨小鼠T细胞系染色质免疫共沉淀(ChIP)实验操作

实验操作步骤
     第1和第2天
     细胞交联
     ➤ 小鼠T细胞从培养板转移到50 mL离心管,4°C条件下271 g离心5 min,用30 mL IMDM细胞培养基重悬细胞颗粒,用Neubauer室计数细胞。

     ➤ 收集20×106细胞到新的50 mL管中。

     ➤ 直接在细胞培养基中添加甲醛(FMA),使终浓度为1%,室温培养10 min。注意:吸入FMA是有毒的,所以工作时穿上适当的防护设备。另外,请按废液处理标准处理FMA废液。

     ➤ 添加1/8体积的1 M甘氨酸,pH为7,室温下孵育5 min。

     ➤ 4°C条件下271 g离心5 min收集细胞,再用10 mL PBS冲洗。

     ➤ 用1 mL PBS冲洗细胞颗粒,移液至1.5 mL管中。

     细胞溶解与染色质破碎
     ➤ 用1 mL SDS裂解缓冲液悬浮细胞颗粒,冰上孵育10 min。

     ➤ 每个样品用超声破碎:VCX750,25%功率,4.5 s冲击,9 s间隙。共14次。

     ➤ 剪切后,将样品移到1.5 mL离心管中,4°C条件下18000 g离心10 min。

     ➤ 将上清液转移到新的离心管中。

     ➤ 先用50 µL按照步骤三检测破碎效率,其他的超声破碎产物分装后在液氮中快速冷冻置于-80°C保存。

     破碎效率的测定
     ➤ 50 µL超声破碎产物中加50µL洗脱缓冲液,65°C过夜摇动孵育。

     ➤ 添加100 µL TE缓冲液和4 µL 10 mg/mL RNase A(0.2 µg/µL终浓度)。混匀后37°C摇动孵育2 h。

     ➤ 添加2 µL 20 mg/mL蛋白酶K(0.2 µg/µL终浓度),混匀后55°C摇动孵育2 h。

     ➤ 将每个样品转移到适合于苯酚/氯仿/异戊醇萃取的凝胶管中,按照制造商的指示处理。

     ➤ 添加200 µL的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),摇匀。24°C条件下16000 g离心5 min,上清转移到新的管中。注意:酚、氯仿和异戊醇有腐蚀性,请在通风橱下操作,并穿戴适当的防护设备。此外,请按废液处理标准处理废液。重复一次本步骤。

     ➤ 使用纯化柱纯化DNA,根据说明书进行操作。

     ➤ 测量DNA的浓度。

     ➤ 在1.8%琼脂糖凝胶上分析大约500 ng的纯化DNA。注意:DNA片段的预期大小介于200到500 bp之间。

     第3和第4天
     免疫共沉淀
     ➤ 用5倍体积稀释缓冲液稀释超声破碎产物。

     ➤ 加30 µL/mL protein A agarose beads在寒冷的房间里旋转30 min。

     ➤ 4°C条件下750 g离心5 min。

     ➤ 收集10%作为input储存在4°C。

     ➤ 其他产物中添加所需抗体(详见下表),并在4°C旋转过夜。

     ➤ 添加40 µL protein A beads,在4°C旋转孵育1 h。

     ➤ 分别用1 mL低盐缓冲液、高盐缓冲液、LiCl缓冲液、TE缓冲液洗沉淀复合物。清洗步骤:加入溶液,在4°C旋转孵育10 min,4°C条件下950 g离心3 min,除去上清。

     ➤ 添加110 µL洗脱缓冲液,室温孵育15 min,每2 min搅拌一次。

     ➤ 4°C条件下950 g离心3 min,100 µL上清液转移到一个新的1.5 mL管中。

     ➤ 按照7-8的步骤,用100 µL洗脱缓冲液与洗脱物结合。在input样本中加入200 µL洗脱液。

     ➤ 将所有的样品在65°C摇动过夜。

     第5天
     DNA纯化
     ➤ 添加200 µL TE缓冲液和8µL 10 mg/mL RNase A(0.2 µg/µL终浓度),混匀后在37°C摇动孵育2 h。

     ➤ 添加4 µL 20 mg/mL蛋白酶K(0.2 µg/µL终浓度),在55°C摇动孵育2 h。

     ➤ 将每个样品转移到适合于苯酚/氯仿/异戊醇萃取的凝胶管中,按照制造商的指示处理。

     ➤ 添加400 µL的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),摇匀。24°C条件下16000 g离心5 min,上清转移到新的管中。注意:酚、氯仿和异戊醇有腐蚀性,请在通风橱下操作,并穿戴适当的防护设备。此外,请按废液处理标准处理废液。

    重复一次本步骤。

     ➤ 使用纯化柱纯化DNA,根据说明书进行操作。最终溶于50µL去离子水中。
        


                图1、CHIP实验的原理和步骤图示



                图2、成年小鼠T细胞系破碎效率的检测

     (A)成熟小鼠T细胞系E2-10HA的破碎效果,大约500 ng纯化的DNA在1.8%的琼脂糖凝胶进行破碎效率的分析。

     (B)用电泳法对样品1和2的纯化DNA进行分析,评价其破碎质量。
        
                             图3、增强剂和促进剂的染色质标记

     表 /实验中用到的试剂配方
           
     参考文献:Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines.J Vis Exp. 2017 Jun 17;(124). DOI: 10.3791/55907.

     想要了解更多请关注:http://www.chinazglab.com/

上一篇:22个领域对实验人员的要求,赶紧对照下!
下一篇:实验专栏丨小鼠胃食管反流的外科手术模型
分享到: