实时荧光定量PCR作为实验室最常用的实验。研究基因在mRNA表达水平,以及验证基因敲除后下游靶基因变化情况等等。
首先，实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
最常用的方法有SYBRGreenⅠ与 TaqMan探针法。下面介绍一下原理：
1、SYBRGreenⅠ法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
2、TaqMan探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。因此他每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
QPCR的扩增曲线图（中洪实拍图）
在进行实时荧光定量PCR引物设计之前，大家都应该了解引物设计需要注意的一些细节与原则。（如下图所示）
那么当我们有了引物，如何利用荧光定量PCR实验来检测mRNA水平呢？今天小编先教给大家Real—time PCR最重要的第一步，如何抽提高质量的RNA？
一、 样品 RNA 的抽提
取冻存已裂解的细胞，室温放置 5 分钟使其完全溶解。
两相分离 每 1 ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2 ml 的氯仿，盖紧管盖。剧烈振荡管体 20-30秒后，静置5min。4 ℃ 下 12 000 rpm 离心 15 分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色有机相，中间层以及无色水相上层。RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 TRIZOL 试剂的 60%。
RNA 沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的 RNA，混匀后 15 到 30℃ 孵育 10 分钟后，于 4℃ 下 12 000 rpm 离心 10 分钟。此时离心前不可见的 RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
RNA 清洗 移去上清液，每 1 mlTRIZOL 试剂裂解的样品中加入至少 1 ml 的 75% 乙醇（75% 乙醇用 DEPCH2O 配制），清洗 RNA 沉淀。混匀后，4℃ 下 7 000 rpm 离心 5 分钟。
RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA 沉淀在室温空气中干燥 5～10 分钟。
溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 时，先加入无 RNA 酶的水 40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的 RNA 溶液保存于 -80 ℃ 待用。
是不是很简单呢,其实做实验我们要知道每步加入试剂的作用和意义，做到心中有数，小心谨慎，熟能生巧，那从实验菜鸟进阶到实验高手也是很简单的事情。如果我们成功抽提RNA,接下来我们可以反转录cDNA进行Real-time PCR实验。
实验前准备Trizol抽提试剂、氯仿、异丙醇（4℃贮存）、75%乙醇（DEPC水配制）、DEPC水、一次性枪头、进口1.5mlEP管、低温高速离心机（提前4℃预冷）。
实验操作步骤一、 RNA反转录cDNA
1、根据RNA定量结果，将1ul随机引物（Oligo)、2ugRNA和适量的无核酸酶水混匀，配制成10ul反应体系。
2、水浴，10min。
3、冰浴，3min。
根据反转录试剂盒说明书，加入以下试剂：
3ul 无核酸酶水
2ul DNTPS
4ul RT缓冲液
0.5ul RNA酶抑制剂
0.5ul 反转录酶，混匀
42℃水浴，1h。
70℃水浴，10min，使逆转录酶失活。
二、上机检测
1、Q-PCR仪提前10到20min开机预热。
2、Q-PCR上机检测。
根据下列比例配置反应体系：
基因表达Q-PCR检测，一般会同时检测内参基因和目的基因。
一般来说，1个样本检测1个基因会设置3-4个复孔，以排除点样操作误差。
5倍稀释cDNA溶液，准备点样。
带上一次性塑料手套，盖紧8连管盖，注意不要碰触盖面。
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