五一假期一过，看着后台满满的回复，中洪君真是痛并快乐着啊！

       目光如炬的我在茫茫回复中提取出双向电泳这一实验大将，今天来跟各位好好唠唠！

中洪实拍图

一、实验原理：

   双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。其操作步骤为第一向等电聚焦、第二向SDS-PAGE电泳。

二、实验操作：

关于样品制备，中洪君有话说：

       样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响 2-DE 结果好坏。目前并没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：

       1、尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的 损失;

       2、减少对蛋白质的人为修饰;

       3、 破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作 用，并使蛋白质处于完全变性状态。

一、细胞样品

       1. 细胞培养，加药与处理。

       2. 胰酶消化贴壁细胞，PBS 漂洗 3 次(1500g，5min)，弃上清，再次离心，去尽残液(非常重要!) 。如要比较细胞膜蛋白组的差别，最好用细胞刮收细获胞。如用 10mMTris/250 mMSucrose(pH7.0)代替 PBS，可有效降低样品的盐浓度。加入5倍体积裂解液，混匀(或将 1×106 细胞悬于 60～100μl 裂解液中) 。

       3. 加 50ug/mlRNase 及 200ug/mlDnase，在 4℃放置 15 分钟。

       4. 15,000 转，4℃离心 60 分钟(或 40,000 转，4℃离心 30 分钟) 。

       5. 收集上清。

       6. 测定蛋白浓度( 采用 BioRadRC/DCprotein assaykit)。

       7. 分装样品，冻存于-70℃。

二、组织样品

       1. 碾钵碾磨组织，碾至粉末状。

       2. 将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。

       3. 加 50ug/mlRNase 及 200ug/mlDNase，在 4℃放置 15 分钟。

       4. 15,000 转，4℃离心 60 分钟(或 40,000 转，4℃离心 30 分钟) 。

       5. 收集上清，测定蛋白浓度。

       6. 分装样品，冻存于-70℃。

双向电泳实验注意事项：

       1. 8 mmol/L PMSF 必须在添加还原剂之前用，否则 PMSF 会失去活性。

       2. 40 mmol/L 浓度以下的 Tris可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。

       3. 细胞清洗――大多用 PBS， 若PBS 残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹，则可利用(10 mmol/L Tris,250 mmol/L sucrosepH 7.0)來解決此问题。

三. 常见问题及解答

   1.重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？

   一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。

   2.为什么在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？

   这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（80％满）的矿物油。

   3.跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？

   电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。

   4.跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？

   刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动。

   5.跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？

   蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。

   6.跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？

   当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。

   7.跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？

   当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。

   8.跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？

   等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气

   9.重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？

   硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。

   10.怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值？

   可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准，也可以用体系内已知蛋白来做比对。

   11.为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？

   横的脱尾可能是： 1 ）一向等电聚焦不完全； 2 ）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时，蛋白的溶解度不好

   12.什么成分会影响 2D 胶的效果？

   核酸，盐，去垢剂等等

   13.2D 胶的上样量应该在什么范围？

   上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在 100 微克（银染）到 500 微克（考染）之间。

   14.我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？

   蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。沉淀法中，又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。 透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境（ 不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。

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