一. 实验原理及背景

       原位杂交可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。

       菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释放DNA。将DNA烘干固定于膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。

       组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需要裂解细菌释放DNA，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。

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二. 具体步骤

       1、将加入探针的杂交液先于50℃预热，均匀涂于切片表面，加上硅化盖玻片，放于湿盒中，50℃孵育12-16h。

       2、1×SSC（含50%甲酰胺），50℃洗涤2次，每次10min。

       3、2×SSC（含50%甲酰胺），37℃洗涤10min。

       4、2×SSC（0.5ug/ml RNaseA），37℃洗涤30min。

       5、1×SSC，50℃洗涤10min。

       6、1×PBS（含0.1%Tween20），50℃洗涤2次，每次10min。

       7、PBT室温洗涤10min。

       8、封闭液处理1-1.5h。

       9、加抗体（用封闭剂按1:500比例稀释），均匀地涂于切片表面，放于湿盒中，室温1-2h后4℃过夜（抗体1:500稀释于1×封闭液）。

       10、PBT洗涤3次，每次15min。

       11、显色缓冲液洗5min。

       12、滴加显色液，黑暗中显色至适度。可在显微镜下多次观察。

       13、显色终止液洗10min，双蒸水洗5次。

       14、甲基绿（0.25%）滴加染色几秒中，双真水洗5min。

       15、脱水封片。

三.注意事项

➤ 固定液的选择及固定时间

       石蜡组织建议用10%中性缓冲福尔马林固定6～48h，其它固定液对实验结果可能产生一定的影响。组织离体后应尽快固定，建议在标本离体后30min内固定。如样本固定不及时，荧光信号会减弱。固定液的体积是组织体积的4～20倍，否则固定不充分，容易出现无信号或者信号很弱的现象。而且，为了保证信号的准确性，蜡块最好在2年内进行检测，已经切好的切片在6周内检测最佳。

➤ 组织切片和载玻片的选择

       组织切片4～5μm 厚，过厚或过薄的切片均会对信号的强弱产生影响，而且切片应完整，质量良好，否则会在预处理时掉片。载玻片的选择建议使用防脱载玻片，有条件的实验室可使用更好的阳离子或者阴离子专用载玻片，可有效防止脱片现象的发生

➤ 实验过程中切片的预处理

       切片预处理过程包括煮沸处理和蛋白酶消化。当组织处理不规范、切片过厚或烤片不足时，在煮沸过程中容易掉片，建议烤片温度在56℃过夜。煮沸过程中要严格控制实验温度和时间。酶消化是 FISH 实验的关键步骤之一，如果对组织不熟悉，可以先消化推荐的反应时间，然后复染 DAPI在荧光显微镜下观察，在DAPI通道下，以细胞既无空洞(消化过度)，亦无明显的云雾状(消化不足)为最佳，同时可切换观察红绿通道，以红绿通道无明显的背景为佳，如果背景较高，可适当延长消化时间。另外，对于陈旧的石蜡组织切片，要适当延长消化时间，否则会出现大量的自发荧光。

➤ 变性和杂交

       变性和杂交是本实验最关键的步骤，变性的时间和温度是杂交成功是否的关键，为保证变性期间温度的稳定，作者建议采用专业的原位杂交仪进行变性和杂交步骤，不仅能够减少实验的繁琐性，而且更有利于实验条件的控制，比如时间、温度和避光条件等。为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失和防止干片，一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。 

       杂交后洗涤温度、时间和封片保存杂交后的洗涤对于整个实验结果的影响非常重要，首先应保证正确配置杂交洗涤液，洗涤液温度偏高或时间过长，可导致信号减弱，洗涤液温度偏低或者时间过短，会产生杂信号过多、红绿信号对比性差或者特异性低等情况。在复染完 DAPI 以后，加盖盖玻片，用指甲油固定住盖玻片四角，这样可以防止在油镜下观察时盖玻片脱落。由于荧光信号容易淬灭，所以在染色后应立即观察，如果当时不能观察，可将切片放入切片盒中，保存于－20℃冰箱里2周以内。 设置对照每次实验需设置标准对照: 实验室在每一轮检测中均应使用标准化对照材料( 阳性、阴性和可疑)。如果对照材料没有显示预期的结果，则不能对结果做出判定。

➤ 结果判读

       应选择细胞核大小一致、核边界完整、DAPI染色均一、细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润性癌细胞核中的双色信号。判读标准参考《乳腺癌 HER-2检测指南(2014版)》，对于FISH结果不确定的病例，需要再计算20个细胞核中的信号或由另外一位病理诊断医师重新计数。如仍为临界值，则应行免疫组化检测(若FISH检测前未行)，也可以选取不同的组织块重新检测。

四、部分试剂配置

       1 0.1mol/L三乙醇胺-0.25%乙酸酐：三乙醇胺13.2ml，氯化钠5g，浓盐酸4ml，DEPC水定容至约1000ml，临用前，一边摇动溶液一边加入乙酸酐2.5ml，充分混合。

       2 10×PBS：氯化钠 80g，Na2HPO4·12H2O2 32.3g，NaH2PO4·2H2O2 4.5g。加DEPC水900ml，用HCl/NaOH调pH至7.2，最后定容为1000ml。

       3 20×SSC（pH=7.0）：氯化钠175.3g，枸橼酸钠88.2g，DEPC水（ddH2O）定容至1L。

       4 100×Denhardts：Ficoll1g，PVP1g，BSA1g，DEPC水定容至50mL。

       5 预杂交液：2×SSC，50%甲酰胺，100ug/ml变性鱼精DNA，5×Denhardts。

       6 杂交液：2×SSC，50%甲酰胺,1×Denhardts,250μg/mL酵母tRNA或100μg/mL变性鱼精DNA,10mmol/L Tris-HC1 (pH7.5)，0.5％SDS，5％葡聚糖硫酸酯，标记探针。

       7 PBT：1×PBS，0.1％Triton×100，2mg/mL BSA使用前加入。

       8 封闭液：0.1mol/L Tris-HCI pH7.5，0.15mol/L NaCI，0.5％羊血清或2％BSA。

       9 显色缓冲液：100mmol/L Tris-HCI pH9.5，100mmol/L NaCI，50mmol/L MgCl2。

       10 显色液：4.5μL/mL NBT，3.5μL/mL BCIP，用显色缓冲液配制。

       11 显色终止液：0.1mol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L EDTA。