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细胞凋亡的形态学检测方法有哪些?

       细胞凋亡的早期形态学改变是核染色质浓聚、固缩,聚集在核膜周边,然后是胞浆浓缩、胞膜起泡,继而细胞核裂解成若干碎片,细胞膜将胞质和染色质断片包裹,胞浆内形成多个膜结构尚完整的“小泡”及 “凋亡小体” (apoptoticbody)。这不同于细胞坏死的细胞肿胀、胞膜破裂、细胞崩解。


       根据凋亡细胞固有的形态特征,至今为止,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。


一、光学显微镜观察


       凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染,形成致密质块,有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小,胞质致密、嗜酸性染色增强,并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在,凋亡细胞与周围细胞分离,不引起炎症反应。


       本方法简便易行,但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难,常缺乏较为特征的指标,具有较强的主观性,重复性差。本方法可用于调亡现象的初步观察,作为分析指标之一。


       检测方法:细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色,在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变,结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。



图一 HeLa 细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化


二、视频时差显微技术


       本方法用于细胞培养,通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程,尤其是观察细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离,胞体变圆、收缩、出泡,有的细胞拉长,出现钉状突起,特续数小时后细胞膜破裂,细胞溶解,通过连续观察,本方法可养壑培养中的凋亡细胞,但不能用于病理组织。


       检测方法:收集2×105细胞/ml培胞,置于多孔培养板,加入凋亡诱导剂,在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变,每隔分钟30秒作序列摄影,连续24小时。如同进进行荧光染色,可参荧光晃微镜下观察和摄影。


三、电子显微镜观察


       虽然光学显微镜下可以看见胞膜起泡现象和凋亡小体,但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构,因此用光镜观察难以令人满意,而透射电镜可清楚地观察到细胞结构在凋亡不同时期的变化。电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最经典、最可靠的方法,被认为是确定细胞凋亡的金标准。


缺点:

       (1)只能定性,不能定量;

       (2)标本处理过程复杂,设备相对昂贵,对检查者的技术水平要求较高,不适于大批标本检测;

       (3)在组织切片上进行电镜观察时,有时凋亡很难与正常细胞有丝分裂相鉴别,因为两种情况下都可出现染色质浓聚。如同时进行荧光染色,可弥补电镜检查的不足。


       检测方法:透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定,丙酮脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸枸椽酸电子又重染色,透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定,乙醇逐级脱水,CO2临界点干燥,真空喷金,扫描电镜观察。



图2 电子显微镜观察Jurkat细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化


四、流式细胞技术


       流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射,分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光两种,前向散射光的强度与细胞大小、体积相产,右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性(granu-larity)有关。


       细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性发生改变。早期凋亡细胞主要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变,前者反映了细胞的皱缩,后者反映了细胞的核逐缩及碎裂。晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均减弱。


       由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标,细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。因此,只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。


       细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解,导致小分子DNA漏出,核DNA含量下降,细胞荧光染色后作流式细胞仪分析,可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰(xub-G1峰,即AP峰--apoptotic peak),代表凋亡细胞。


       根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。此外,流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。


       检测方法:获取密度1×106细胞/ml左右的细胞悬液,精洗,固定,荧光染料染色,上流式细胞仪分析。

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