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一文掌握 BrdU标记法检测细胞增殖

       细胞增殖检测已经广泛应用于分子生物学、肿瘤生物学、免疫学和大规模药物筛选等研究领域。


检测方法主要分为两类:

  • 一类是直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞增殖能力,如Ki67、BrdU以及EdU细胞增殖检测等;

  • 一类是通过测定活性细胞数目来间接反映细胞增殖能力,如MTT、CCK-8等。

具体实验可参考:

      1、实验专栏丨这5年做MTT实验的总结都在这儿了

      2、实验专栏丨一文掌握CCK-8细胞增殖与毒性检测法


      直接测定DNA合成是细胞增殖检测的最准确方法之一,是测定物质毒性、评估药物安全评价、细胞健康的基本方法,其中常用的方法有BrdU标记法。

BrdU检测原理


       用BrdU预处理的细胞中,BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中,而且这种置换可以稳定存在,并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后,可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记,最后用比色法或荧光的方法进行定量测定),从而判断细胞的增殖能力。


实验步骤


       1.细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中(内放置一盖玻片),培养1 d,用含0.4%FBS培养液同步化3 d,使绝大多数细胞处于G0期。

       2.加入BrdU(储液:1.0 mg/ml,终浓度为0.03 μg/ml),37℃,孵育40min。

       3.弃培养液,玻片用PBS洗涤3次。

       4.甲醇/醋酸固定10 min。

       5.经固定的玻片空气干燥,0.3%H2O2-甲醇30 min灭活内源性氧化酶。

       6.5%正常兔血清封闭。

       7.甲酰胺100℃,5 min变性核酸。

       8.冰浴冷却后PBS洗涤,加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1:50),阴性对照加PBS或血清。

       9.按ABC法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数,计算标记指数(LI)。


注意事项


       1.BrdU配制方法:10 mg溶于10 ml双蒸水,4℃下避光保存

       2.BrdU会肌体造成不可逆损伤,使用时注意安全,避免吸入BrdU粉尘。



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