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你真的用Image J测到了WB条带灰度值吗?

       关于用Image J量化westernblot条带灰度值,在网上一直盛传着两种操作方法,然鹅~小伙伴们却一直不确定到底哪种才是正确的测量灰度方法,甚至将灰度与光密度弄混淆。今天咱们一起就这个机会学习下,请先看看你是用以下哪种方法测量灰度值?以下是两种方法的具体操作。


方法一


       1、打开Image J软件→左上角file→Open 选择自己的条带图片(事先把条带摆正)


       2、把图片转化成灰度图片:Image→type→8-bit


       3、第一个矩形工具→选上所有条带



       4、analyze→Gels→select first lane→Gels→plot lanes(在这第四步也可以分开选取,如:框选第一个条带→analyze→Gels→select firstlane→将第一个框拖移到余下条带→Gels→select nextlane)


       5、选中直线工具,将开口波峰关闭



       6、选中魔棒工具(正数第七个),点击波峰,就得出所有area值。



方法二


       1、打开Image J软件→左上角file→Open 选择自己的条带图片(事先把条带弄正)


       2、把图片转化成灰度图片:Image→type→8-bit


       3、扣除背景:Process→Subtract Background→50pixels 并勾选Light Background



       4、设定参数:Analyze→set measurement→勾选Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density

       5、Analyze→set scale→unit of length选项里改为pixels,确定



       6、图像分割。Edit→Invert→选中椭圆圈(手残党首选)/不规则圆圈(心灵手巧党义无反顾),手动圈上单个条带



       7、Analyze→Measurement即得到Intden,重复6、7步就得到所有Intden值

       小伙伴们,你们是哪种方法呢?首先先把结论说出来,其实两者得出的area和Intden严格来说都不是灰度值,前者是面积而后者是光密度值,但用来量化WB条带都是OK的。


       Image J这个软件在将western blot条带量化时存在两种参数:灰度与光密度(假,暂且这么称呼,原因下文再说),这两者在理解使用Image J量化WB条带十分重要,请务必仔细看以下几个概念。


       1、灰度(gray):是指图像中各种颜色的深浅程度, 它以整数值表示, 一般的图像分析软件将图像每个像素点的颜色分为 0-255共 256 级,每一像素点对应的数值即灰度,灰度值越小物体颜色越深。有兴趣的小伙伴,可以随意用Image J打开一张图片,光标在图片上任意移动,得到的value值最小为0(纯黑),最大为255(纯白)。


       2、光密度(OD,真):也就是吸光度(A), 光线通过溶液或某一物质前的入射光强度Io与该光线通过溶液或物质后的出射光强度Ib比值的对数OD=lg(Io/Ib),其实就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比尔定律。


       明确这两个概念后,我们再来看为什么称Image J里的光密度是“假”,因为在图像分析中的光密度(假)是由灰度值再经计算得到的, 它是一个相对值, 但其算法与 OD 值的算法类似。只是它的入射光强度由Western blot胶片上最亮区域的平均灰度值代替, 而出射光强度则由待测目标平均灰度值代替。


       即:图像分析系统的光密度值=lg(WB胶片上最亮区域的平均灰度值/ 待测目标的平均灰度值),再简单点来说,就是光密度(假)和正儿八经的灰度值有血缘关系。


       总结起来说灰度与光密度(假)都能用来量化western blot条带,两种量化任君随意挑。


现在说回两种操作方法:


方法一:

       是通过每个条带上众多像素点对应的灰度值勾画出一条曲线,最后魔棒点出算出的area值其实就是该条带所对应的面积大小。条带越大,area值越大。


方法二:

       是通过上文说到的光密度(假)计算方法得出来的,最后得出的Intden值是所圈面积下的总光密度值,再除以圈下面积area,得出的是平均光密度值(图像中阳性区域每一像素点的 OD 值叠加后除以测量的面积)。条带(颜色反转后)越白越亮则Intden/area越大。


       所以严格意义上来说,方法一方法二最后得出的数据都不属于正儿八经的灰度值,但又与灰度值有着千丝万缕的联系。如果只是量化WB条带,两种方法是都能选用的,记得标注你得到的结果是area还是Intden,但如果你想测出真正的灰度值,那么我们下节课再来好好谈谈,咦?我说话怎么越来越像老师的风格呢,哈哈,同学们,下课!


       ▍来源:实验万事屋

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