细胞周期是指细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的时间,它代表着生命从一代向下一代传递的连续过程,与前几期我们介绍过的细胞学实验(细胞增殖、克隆形成等)一样,细胞周期也是评价细胞增殖功能的重要实验。
流式细胞仪是检测细胞周期最常用的方法,然而我们会碰到细胞量不够、细胞碎片太多等原因,导致实验一次次重复,本文就一起看看如何把细胞周期的数据变的更加漂亮,准确!
一、细胞周期简介
主要分为以下2大过程:
分裂间期:间期又分为三期、即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期);
分裂期M期:细胞分裂期,指细胞分裂开始到结束。
注:G0期是指某些细胞在分裂结束后会暂时离开细胞周期,停止细胞分裂;但在一定适宜刺激下,又可进入周期;
因为分裂间期持续的时间远远比分裂期持续时间长,在一个正常细胞周期中,分裂间期时间会占整个细胞周期的90%~95%;
不同类型细胞的G1期时间长短不同,所以其细胞周期时间存在差异。如:人类胃上皮细胞为24小时,骨髓细胞为18小时,HeLa细胞为21小时。
二、实验步骤
1. 细胞培养:取对数生长期的细胞,按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内,进行所需的处理(比如加入药物),特定时间后终止培养,进行下一步的实验。
2. 细胞固定:800rpm离心5min,收集细胞沉淀,弃上清,用预冷PBS洗涤两次,加入预冷75%乙醇,于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色:800rpm离心5min,弃上清,以3mL的PBS洗涤一次,加入400uL溴化乙锭(PI,50ug/mL),100ulRNaseA(100ug/mL ),4℃避光孵育60min。
4. 流式分析:以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数2~3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。注:上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞!因为PI具有很强的粘附性,容易使细胞聚团!
有关流式细胞周期结果图解读
1、纵坐标Cell Number:即计数的有效细胞数;
2、横坐标DNAContent:即DNA含量;
3、G1、G2、S三期在图中已经标示;4、右侧数字含义:Dip G1-38.81% at 68.59,即G1期DNA含量平均值为68.59;即G1期细胞数占总数的38.81%;Dip G2-15.32% at 131.69,即G2期DNA含量平均值为131.69,G2期细胞数占总数的15.32%;以此类推…
常见问题解答
1、是否可以直接用70~75%的乙醇固定细胞?
不可以,直接70~75%乙醇加入很容易导致细胞聚团现象,很难重悬成单细胞,影响固定效果,甚至容易导致固定后无细胞沉淀的现象。正确做法是:待细胞充分分散成单细胞后,缓慢地滴入无水乙醇中,使其终浓度为70~75%乙醇。
2、上机细胞量过少,无法获得数据结果?
首先,要保证收集足够的细胞样品(个人经验至少收集100万左右);如果药物处理后细胞死亡过多,应该降低药物浓度;
其次,固定细胞时先用预冷的PBS重悬细胞,再逐滴滴入无水乙醇中;
细胞清洗时,不可过度吹打细胞,以防产生过多的细胞碎片;
最后,尽量采用尖底的离心管和水平的离心机,离心后尽量用移液枪吸走上清,不要倾倒,残留一点,不要吸完;
3、什么样的数据结果可以用?
G2/M期细胞的DNA含量是G1期的2倍,在直方图上形成一个2倍于G1信号峰的高斯峰;
CV(变异系数)表示峰的宽度,CV值越小,峰形越好,最好是在5%左右,一般小于10%也被认可。
RCS最好是在1~3,高于5则不被认可。RCS高,说明数据的分布和软件所建立模型的预期值的差别比较大,可能由于处理细胞的时候RNA酶消化不好,或者是PI的浓度不佳造成的。
4、在实验操作过程中,如何提高G0/G1峰分辨率和精确度?
变异系数(Coefficient of Variation,CV值)反映G0/G1峰分辨率和精确度。而样品CV值为样品固有,与样本制备过程中细胞质量有关。细胞碎片越少、细胞聚团越少、RNA酶消化越充分,可以减少样本的CV值,提高G0/G1峰分辨率和精确度。
中洪服务
一、服务项目
1、细胞鉴定
2、细胞凋亡
3、细胞周期检测
4、ROS检测胞内活性氧
5、淋巴细胞亚群分析
二、实验流程
细胞处理→细胞标记→流式细胞仪检测分析→图像与数据处理。
2、上机细胞量过少,无法获得数据结果?
首先,要保证收集足够的细胞样品(个人经验至少收集100万左右);如果药物处理后细胞死亡过多,应该降低药物浓度;
其次,固定细胞时先用预冷的PBS重悬细胞,再逐滴滴入无水乙醇中;
细胞清洗时,不可过度吹打细胞,以防产生过多的细胞碎片;
最后,尽量采用尖底的离心管和水平的离心机,离心后尽量用移液枪吸走上清,不要倾倒,残留一点,不要吸完;
3、什么样的数据结果可以用?
G2/M期细胞的DNA含量是G1期的2倍,在直方图上形成一个2倍于G1信号峰的高斯峰;
CV(变异系数)表示峰的宽度,CV值越小,峰形越好,最好是在5%左右,一般小于10%也被认可。
RCS最好是在1~3,高于5则不被认可。RCS高,说明数据的分布和软件所建立模型的预期值的差别比较大,可能由于处理细胞的时候RNA酶消化不好,或者是PI的浓度不佳造成的。
4、在实验操作过程中,如何提高G0/G1峰分辨率和精确度?
提高G0/G1峰分辨率和精确度。
下一篇:没有了