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实验专栏丨这有一份细胞周期检测步骤及结果解析,请查收!

细胞周期是指细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的时间,它代表着生命从一代向下一代传递的连续过程,与前几期我们介绍过的细胞学实验(细胞增殖、克隆形成等)一样,细胞周期也是评价细胞增殖功能的重要实验。

 

 流式细胞仪是检测细胞周期最常用的方法,然而我们会碰到细胞量不够、细胞碎片太多等原因,导致实验一次次重复,本文就一起看看如何把细胞周期的数据变的更加漂亮,准确!

 一、细胞周期简介

 

主要分为以下2大过程:

 分裂间期:间期又分为三期、即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期);

 分裂期M期:细胞分裂期,指细胞分裂开始到结束。

 


注:G0期是指某些细胞在分裂结束后会暂时离开细胞周期,停止细胞分裂;但在一定适宜刺激下,又可进入周期;

 

 因为分裂间期持续的时间远远比分裂期持续时间长,在一个正常细胞周期中,分裂间期时间会占整个细胞周期的90%95%

 

 不同类型细胞的G1期时间长短不同,所以其细胞周期时间存在差异。如:人类胃上皮细胞为24小时,骨髓细胞为18小时,HeLa细胞为21小时。

 

 二、实验步骤

 

 1. 细胞培养:取对数生长期的细胞,按1×106cells/ mL1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内,进行所需的处理(比如加入药物),特定时间后终止培养,进行下一步的实验。

 

2. 细胞固定:800rpm离心5min,收集细胞沉淀,弃上清,用预冷PBS洗涤两次,加入预冷75%乙醇,于4℃固定4h以上。

 

3. 细胞染色:800rpm离心5min,弃上清,以3mLPBS洗涤一次,加入400uL溴化乙锭(PI50ug/mL),100ulRNaseA100ug/mL ),4℃避光孵育60min

 

4. 流式分析:以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数2~3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。注:上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞!因为PI具有很强的粘附性,容易使细胞聚团!

 

有关流式细胞周期结果图解读  


 

1、纵坐标Cell Number:即计数的有效细胞数;

 

2、横坐标DNAContent:即DNA含量;

 

3G1G2S三期在图中已经标示;4、右侧数字含义:Dip G1-38.81% at 68.59,即G1DNA含量平均值为68.59;即G1期细胞数占总数的38.81%Dip G2-15.32% at 131.69,即G2DNA含量平均值为131.69G2期细胞数占总数的15.32%;以此类推…

 

 

常见问题解答

 

1、是否可以直接用70~75%的乙醇固定细胞?

 

 

 

不可以,直接70~75%乙醇加入很容易导致细胞聚团现象,很难重悬成单细胞,影响固定效果,甚至容易导致固定后无细胞沉淀的现象。正确做法是:待细胞充分分散成单细胞后,缓慢地滴入无水乙醇中,使其终浓度为70~75%乙醇。


 

2、上机细胞量过少,无法获得数据结果?

 

 

 

首先,要保证收集足够的细胞样品(个人经验至少收集100万左右);如果药物处理后细胞死亡过多,应该降低药物浓度;

 

 

 

其次,固定细胞时先用预冷的PBS重悬细胞,再逐滴滴入无水乙醇中;

 

 

 

细胞清洗时,不可过度吹打细胞,以防产生过多的细胞碎片;

 

 

 

最后,尽量采用尖底的离心管和水平的离心机,离心后尽量用移液枪吸走上清,不要倾倒,残留一点,不要吸完;

 

 

3、什么样的数据结果可以用?

 

 

 

G2/M期细胞的DNA含量是G1期的2倍,在直方图上形成一个2倍于G1信号峰的高斯峰;

 

 

 

CV(变异系数)表示峰的宽度,CV值越小,峰形越好,最好是在5%左右,一般小于10%也被认可。

 

 

 

RCS最好是在1~3,高于5则不被认可。RCS高,说明数据的分布和软件所建立模型的预期值的差别比较大,可能由于处理细胞的时候RNA酶消化不好,或者是PI的浓度不佳造成的。

 

 

4、在实验操作过程中,如何提高G0/G1峰分辨率和精确度?

 

 

 

变异系数(Coefficient of VariationCV值)反映G0/G1峰分辨率和精确度。而样品CV值为样品固有,与样本制备过程中细胞质量有关。细胞碎片越少、细胞聚团越少、RNA酶消化越充分,可以减少样本的CV值,提高G0/G1峰分辨率和精确度。

 

 

中洪服务

 

一、服务项目

 

1、细胞鉴定

 

2、细胞凋亡

 

3、细胞周期检测

 

4ROS检测胞内活性氧

 

5、淋巴细胞亚群分析

 

二、实验流程

 

细胞处理→细胞标记→流式细胞仪检测分析→图像与数据处理。

 

 


 

 

2、上机细胞量过少,无法获得数据结果?

 

 

 

首先,要保证收集足够的细胞样品(个人经验至少收集100万左右);如果药物处理后细胞死亡过多,应该降低药物浓度;

 

 

 

其次,固定细胞时先用预冷的PBS重悬细胞,再逐滴滴入无水乙醇中;

 

 

 

细胞清洗时,不可过度吹打细胞,以防产生过多的细胞碎片;

 

 

 

最后,尽量采用尖底的离心管和水平的离心机,离心后尽量用移液枪吸走上清,不要倾倒,残留一点,不要吸完;

 

 

3、什么样的数据结果可以用?

 

 

 

G2/M期细胞的DNA含量是G1期的2倍,在直方图上形成一个2倍于G1信号峰的高斯峰;

 

 

 

CV(变异系数)表示峰的宽度,CV值越小,峰形越好,最好是在5%左右,一般小于10%也被认可。

 

 

 

RCS最好是在1~3,高于5则不被认可。RCS高,说明数据的分布和软件所建立模型的预期值的差别比较大,可能由于处理细胞的时候RNA酶消化不好,或者是PI的浓度不佳造成的。

 

 

4、在实验操作过程中,如何提高G0/G1峰分辨率和精确度?

 

 

 


变异系数(Coefficient of VariationCV值)反映G0/G1峰分辨率和精确度。而样品CV值为

提高G0/G1峰分辨率和精确度。




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