凝胶迁移实验（EMSA）实验2
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-11-15
四、Super-Shift EMSA
非纯化的蛋白样本和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。确定复合物中蛋白的特征可能会困难，可以加入目的蛋白的抗体，进行超迁移实验，即Super-Shift EMSA。抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合，使复合物的迁移延迟，形成超迁移。
Super-Shift EMSA工作原理；在反应体系中，抗体与DNA/蛋白复合物中的蛋白产生反应形成复合物会引起复合物的体积变大，在非变性凝胶中的移动变慢而与DNA/蛋白复合物区别开。
进行Super-Shift EMSA需要考虑以下因素：
1）一般先做一般的EMSA测定，成功后才考虑做Super-Shift EMSA实验。
2）不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。
3）抗体的浓度要高。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。
3）为减少非特异性反应，尽量使用纯化的抗体。
4）单抗与多抗都可用于Super-Shift EMSA，但多抗可能与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。
五、常见问题
1、为什么看不到迁移带？
1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。
2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。
3）探针与蛋白无特异性的相互作用。
4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。
5）曝光或者成像时间过短。
在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因：
6）抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。
7）测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带，也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少。
8）使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。
9）多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。
2、为什么实验背景高？
1）曝光或者成像时间过长。
2）封闭时间不足或者效率不高。
3）洗涤效果不佳
4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。
3、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针？
对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。
部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应保存在-20℃以防止降解。
无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。
4、Poly(dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA在EMSA测定中的作用？
Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶组成。在EMSA反应中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式实验前进行优化，一般用量大约在0.05mg/ml左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。
为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，特异竞争探针是非标记的DNA，其序列与标记探针相同，故能与标记探针竞争与结合蛋白的反应。非特异竞争探针的长度组成和DNA探针相同，但序列不同。如果结合蛋白与标记探针的结合被特异竞争探针抑制，而不受非特异探针的影响表明靶结合蛋白的存在。特异与非特异性竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是标记的探针用量的30-100倍（w/w）。
5、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？
将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%，在特定条件下可用高或低的浓度。也可将TGE缓冲液（12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。在4℃进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。
当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。（转帖）
非纯化的蛋白样本和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。确定复合物中蛋白的特征可能会困难，可以加入目的蛋白的抗体，进行超迁移实验，即Super-Shift EMSA。抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合，使复合物的迁移延迟，形成超迁移。
Super-Shift EMSA工作原理；在反应体系中，抗体与DNA/蛋白复合物中的蛋白产生反应形成复合物会引起复合物的体积变大，在非变性凝胶中的移动变慢而与DNA/蛋白复合物区别开。
进行Super-Shift EMSA需要考虑以下因素：
1）一般先做一般的EMSA测定，成功后才考虑做Super-Shift EMSA实验。
2）不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。
3）抗体的浓度要高。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。
3）为减少非特异性反应，尽量使用纯化的抗体。
4）单抗与多抗都可用于Super-Shift EMSA，但多抗可能与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。
五、常见问题
1、为什么看不到迁移带？
1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。
2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。
3）探针与蛋白无特异性的相互作用。
4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。
5）曝光或者成像时间过短。
在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因：
6）抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。
7）测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带，也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少。
8）使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。
9）多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。
2、为什么实验背景高？
1）曝光或者成像时间过长。
2）封闭时间不足或者效率不高。
3）洗涤效果不佳
4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。
3、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针？
对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。
部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应保存在-20℃以防止降解。
无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。
4、Poly(dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA在EMSA测定中的作用？
Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶组成。在EMSA反应中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式实验前进行优化，一般用量大约在0.05mg/ml左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。
为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，特异竞争探针是非标记的DNA，其序列与标记探针相同，故能与标记探针竞争与结合蛋白的反应。非特异竞争探针的长度组成和DNA探针相同，但序列不同。如果结合蛋白与标记探针的结合被特异竞争探针抑制，而不受非特异探针的影响表明靶结合蛋白的存在。特异与非特异性竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是标记的探针用量的30-100倍（w/w）。
5、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？
将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%，在特定条件下可用高或低的浓度。也可将TGE缓冲液（12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。在4℃进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。
当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。（转帖）
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