聚合酶链式反应(PCR)3
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2018-04-12
注意事项
1. 由于PCR反应灵敏度很高，因此要特别主意防止DNA污染的发生。样品间的相互污染可能产生假阳性结果，特别是将PCR技术应用到临床病原菌感染确定中。
2. 如果是公用的、没有密码保护的PCR仪，经常检查PCR仪上的程序正确与否。
3. 不使用过量试剂“less is usually better (more specific)”。
4. 试剂购回后应分装成小份使用，这样一旦有污染发生，可以立即丢弃污染的试剂，不会造成大的损失；试剂分装也有助于减少反复冻融次数（例如dNTPs对反复冻融敏感）。
5. 加完所有试剂后用枪头吹打几次或稍微涡旋或轻弹管壁以保证充分混匀。
6. 使用阴性对照检查污染的发生。
7. 使用阳性对照（能良好扩增的样本）。
8. 电泳时使用DNA分子量标准品（指示是否PCR失败或条带跑出凝胶或拍照系统失败）。
9. 当扩增很长的、GC含量高的模板时或容易产生二级结构的模板时适量使用添加剂（glycerol, formamide, NMP使变性和退火温度降低几度；glycerol也可起到稳定聚合酶活性的作用；DMSO 减少二级结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性）。
10. 不使用带有自动除霜功能的冰箱存储酶（避免反复冻融），每次取酶时都使用新的枪头酶，酶使用后应立即放回冰箱。酶要在加完缓冲液后再加，直接将酶加入水中可能导致酶变性失活。
1. 由于PCR反应灵敏度很高，因此要特别主意防止DNA污染的发生。样品间的相互污染可能产生假阳性结果，特别是将PCR技术应用到临床病原菌感染确定中。
2. 如果是公用的、没有密码保护的PCR仪，经常检查PCR仪上的程序正确与否。
3. 不使用过量试剂“less is usually better (more specific)”。
4. 试剂购回后应分装成小份使用，这样一旦有污染发生，可以立即丢弃污染的试剂，不会造成大的损失；试剂分装也有助于减少反复冻融次数（例如dNTPs对反复冻融敏感）。
5. 加完所有试剂后用枪头吹打几次或稍微涡旋或轻弹管壁以保证充分混匀。
6. 使用阴性对照检查污染的发生。
7. 使用阳性对照（能良好扩增的样本）。
8. 电泳时使用DNA分子量标准品（指示是否PCR失败或条带跑出凝胶或拍照系统失败）。
9. 当扩增很长的、GC含量高的模板时或容易产生二级结构的模板时适量使用添加剂（glycerol, formamide, NMP使变性和退火温度降低几度；glycerol也可起到稳定聚合酶活性的作用；DMSO 减少二级结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性）。
10. 不使用带有自动除霜功能的冰箱存储酶（避免反复冻融），每次取酶时都使用新的枪头酶，酶使用后应立即放回冰箱。酶要在加完缓冲液后再加，直接将酶加入水中可能导致酶变性失活。
11. PCR产物的电泳检测时间，一般为48 h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
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