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聚合酶链式反应(PCR)4
一、  PCR反应的关键环节
1.  模板核酸的制备。
2.  引物的质量与特异性。
3.  酶的质量。
4.  PCR循环条件。
二、 PCR常见问题及对策
1.  假阴性,不出现扩增条带
 (1)模板原因
①  模板中含有杂蛋白质。
②  模板中含有Taq酶抑制剂。
③  模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白。
④  在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。
⑤  模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。
 (2)酶失活
①  需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。
②  忘加Taq酶或溴乙锭。
 (3)引物
①  引物质量。
②  引物的浓度。
③  两条引物的浓度是否对称。
解决对策:
①  选定一个好的引物合成单 位。
②  引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。
③  引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。
④  引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。
 (4)Mg2+浓度
①  浓度过高降低PCR扩增的特异性。
②  浓度过低影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
 (5)反应体积的改变
①  通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul或100 ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定;
②  在做小体积如20 ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。
 (6)物理原因
①  变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性。
②  退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率;退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
③  扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度有问题。
 (7)靶序列变异
①  靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合。
②  靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列。
2.  假阳性,出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。
 (1)引物设计不合适
①  选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性。
②  靶序列太短或引物太短。
 (2)靶序列或扩增产物的交叉污染
①  整个基因组或大片段的交叉污染。
解决方案:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。
②  空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生。
解决方案:可用巢式PCR方法来减轻或消除。
 3.  出现非特异性扩增:PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
(1)  引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体。
(2) Mg2+离子浓度过高。
(3) 退火温度过低。
(4) PCR循环次数 过多有关。
(5) 酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有:必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。
 4.  出现片状拖带或涂抹带
 (1)原因
 ①  酶量过多。
 ②  酶的质量差。
 ③  dNTP浓度过高。
 ④  Mg2+浓度过高。
 ⑤  退火温度过低。
 ⑥  循环次数过多引起。
(2)对策
① 减少酶量。
②  调换另一来源的酶。
③  减少dNTP的浓度。
④  适当降低Mg2+浓度。
⑤  增加模板量。

⑥  减少循环次数。

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