逆转录 RT-PCR 聚合酶链反应1
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-08-22
实验方法原理
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
实验材料 组织细胞试剂、试剂盒 RNA提取试剂dNTP 混合物Taq DNA聚合酶第一链cDNA合成试剂盒
仪器、耗材 离心管离心机水浴锅PCR管电泳仪凝胶图像分析系统移液管移液枪离心管盒
实验步骤
一、总RNA的提取
见“总RNA的提取”相关内容。二、cDNA第一链的合成
目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
1． 在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 μl。在管中加10 μM Oligo（dT）12-18 1 μl，轻轻混匀、离心；
2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；
3． 取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 μl；上游引物（10 pM） 2 μl；下游引物（10 pM） 2 μl；dNTP(2mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5 min；
4．加入SuperscriptⅡ1 μl ，在42℃水浴中孵育50 min；
5． 于70℃加热15 min以终止反应；
6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
三、PCR
1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；
2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 μl。轻轻混匀，离心；
3．设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；
4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
5．密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
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