【摘要】 在发育或分化的不同阶段以及疾病模型中，利用miRNA特异的芯片能绘制出细胞和组织的miRNA表达谱，这能够揭示出参与了这些进程的特定miRNA。miRNA的过表达和沉默，则是一种有力的方法来研究miRNA的功能。这些研究应当在细胞内或体内进行，并与表型和基因表达分析相结合。
      【关键词】 miRNA    定向克隆    Dicer酶

     lin-4，第一个已知的miRNA，在1993年被发现。自此，miRNA的研究就一发不可收拾。线虫、果蝇等模式生物的研究鉴定出miRNA的许多重要功能，包括发育期间细胞增殖和死亡的协调，抗逆性，脂肪代谢等等。相对于这些低等的模式生物，哺乳动物的miRNA功能研究可就复杂得多。

      在开始的几年，科学家们的首要目标是利用克隆、生物信息学和基因表达等方法编纂出完整的miRNA目录和它的表达方式。随着这个目标日益接近，研究重心又转移至miRNA功能的阐释。针对这一目标，涌现出多种技术，有报告基因分析、原位杂交、过表达和沉默、生物信息学预测算法等，它们都有助于miRNA功能的推断。

     分析miRNA的表达

      在鉴定新的miRNA时，通常采用三种方法：正向遗传学、定向克隆和生物信息学分析。正向遗传学主要运用于果蝇和线虫中，它通过一个突变表型来了解miRNA的功能。第一个miRNA基因lin-4就是这么鉴定出的。然而，正向遗传学这么多年来也就鉴定出寥寥几个miRNA。这是因为miRNA很小，只要突变不影响种子序列，它们就有潜力耐受，因此很难击中。另外，由于冗余，表型筛选不能识别很多miRNA突变体。因此正向遗传学不可能成为鉴定miRNA的主力军。

      之后，定向克隆技术的出现，让多种细胞系和组织中的miRNA大规模鉴定得以实现，包括人、小鼠和斑马鱼等。miRNA的克隆流程大致如下：在变性的聚丙烯酰胺凝胶上分离RNA样品，并回收大小在18-25 nt的片段。接着，给RNA加上5’和3’接头，并进行RT-PCR，然后将片段克隆到载体上，构建出cDNA文库。对单个克隆进行测序和分析，以确定小RNA。目前测序技术的蓬勃发展也大大促进了这种方法。然而对于某些只在特定细胞类型中表达，或以低水平表达的miRNA来说，鉴定起来还是有难度的。另外，介于物理性质或转录后修饰，某些miRNA可能难以克隆，这也是一个棘手的问题。

      同时，科学家们也开发出多种算法，来预测miRNA。所有方法都利用了二级结构信息，因为发夹结构的存在是miRNA的主要特征。其中许多方法还依靠序列的保守性来区分miRNA候选物和无关的基因组发夹。另一些方法则评估发夹结构的热力学稳定性，与已知miRNA的序列和结构相似度。另一种高效的方法是探索已知miRNA周围的基因组序列，因为许多miRNA都是成簇排布。人和小鼠的许多miRNA就是通过这种方式鉴定出的。当然，计算机预测出来的候选miRNA还需要实验的验证。

      有时，我们并不需要全盘了解所有miRNA，而只是想了解发育或分化的不同阶段、某种疾病状态下特异表达的miRNA。这时，芯片就成为一种强大的工具，能监测组织特异的miRNA表达，帮您挑出关键的miRNA。目前市场上多个miRNA芯片包括了最新的Sanger miRBase数据库14.0版的内容，让您能紧跟形势。尽管最初miRNA芯片的交叉杂交和特异性为人诟病，但经过改进，很多已经能够分辨出单个碱基的差异。有了它，人们绘制出细胞分化期间的miRNA表达谱；有了它，人们了解到疾病状态下异常的miRNA表达模式。ABI公司还开发出一种类似芯片的TaqMan miRNA Array，在一张微流体卡片上集合了数百个TaqMan miRNA Assay，尽管通量不如芯片高，但发挥了TaqMan分析的优势——高灵敏度、高特异性和宽动态范围。

     鉴定miRNA的功能

      miRNA的功能研究与基因相似，过表达和沉默是两种有力的方法。miRNA的诱导表达常常是许多研究的第一步。将miRNA模拟物（多个公司有售）转染到细胞中，就能实现miRNA的瞬时过表达。但长期研究就要依赖质粒了。这些重组质粒能源源不断地产生有功能的miRNA，设计起来也很简单。利用常见的蛋白表达载体，将miRNA序列克隆上去，在Dicer酶的切割下，就能产生成熟的miRNA。一些研究小组还将这些质粒引入腺病毒或慢病毒系统，以克服原代细胞或干细胞的转染效率低，或将miRNA导入小鼠体内。不过，仅有miRNA过表达的结论往往不让人信服，我们还需要功能丧失（loss-of-function）实验来证实。

      对于小鼠中的miRNA研究，科学家们开发出一些遗传方法，来产生功能丧失的突变。目前主要有三种：(1) Dicer酶的突变，让所有成熟的miRNA都缺失；(2) 小鼠中miRNA基因的敲除；(3) miRNA 靶位点的突变。不过，miRNA的高度冗余让这种功能丧失研究面临不小的挑战。而且，许多miRNA是成簇排列的，一个miRNA的缺失或干扰可能会影响多顺反子转录本的正确折叠和加工，从而影响相邻miRNA的表达。近年来使用较多的是反义靶定的非遗传学方法。多个公司提供miRNA抑制剂。这些2’-O-甲基修饰的寡核苷酸不可逆地抑制了miRNA的功能。

      上述方法提供了miRNA体外和体内功能研究的框架。在发育或分化的不同阶段以及疾病模型中，利用miRNA特异的芯片能绘制出细胞和组织的miRNA表达谱，这能够揭示出参与了这些进程的特定miRNA。miRNA的过表达和沉默，则是一种有力的方法来研究miRNA的功能。这些研究应当在细胞内或体内进行，并与表型和基因表达分析相结合。

       与转录因子类似，miRNA也是一大类基因调控分子。它们独特的作用方式需要新的分析策略。系统鉴定miRNA以及研究特定miRNA过表达或沉默的生物影响的技术已经有了，但是还需要了解影响miRNA功能的信号通路，以及影响miRNA表达的环境因素或遗传因素。一旦获得这些信息，研究人员才有可能设计出新的治疗策略，来治疗遗传和获得性疾病。（转载）

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