细胞RNA的原位杂交实验用于在混杂的细胞群体和组织中、定位特异的mRNA在细胞中的存在位置。
实验材料
试剂、试剂盒
HCl二甲苯 乙醇 SSC PBS 链霉蛋白酶 甘氨酸 DTT RNA酶消化液 乙酸铵
仪器、耗材
实验步骤
3. 通过如下各组染色盘进行再水化。100%乙醇2次，每次2 min；95%乙醇2 min；70%乙醇2 min，50%乙醇2 min。
4. 样品室温下于0.2 mol/l HCl中变性20 min。
7. 在含10 mmol/l DTT的1×PBS中平衡样品，置45℃水溶10 min。
8. 以新配制的封阻液进行封闭。置45℃水浴30 min，水浴时用铝箔覆盖（碘乙酰胺对光敏感）。
10. 于新配制的TEA缓冲液中，平衡样品2 min，移玻片架于新的TEA缓冲液中，并加 乙酸酐至0.25%终浓度。快速混合，并在搅拌情况下，浸泡玻片5 min。再加乙酸酐至0.5%终浓度，再浸泡5 min。
11. 样品移至2×SSC中浸泡5 min。
14. 离心乙醇沆淀的反链及正链35S标记的核酸探针以及S-核糖核酸探针竞争物。沉淀干后，以5 μl 无菌的5 mmol/l DTT溶解沉淀。加2.5 μl（反应的半量）S-核糖核酸探针竞争剂于反链及正链核糖核酸探计中。
15. 100℃加热3 min，使探针变性。
18. 置样品于加湿盒中（载玻片水平放置），加湿盒内加入加湿盒溶液A，于 45℃温育杂交适当时间。杂交时间可进行30 min~4 h（须平衡湿盒内液体并小心密封湿盒，因为如果样品干了，将导致高杂交本底出现，加湿盒溶液与杂交混合液的渗透压必须相同，以防止杂交液稀释或浓缩）。
20. 开始洗玻片，将载玻片浸入55 ℃ 100 ml 洗液A中，立即放入玻片架并放入盛有溶液A的染色盘中。
22. 每一玻片上加500 μl RNA酶消化液，覆盖样品全部，将玻片放入加湿盒中（盛有水），标明RNA酶专用。室温放置15 min。
23. 在50℃洗液C中，缓慢振摇洗玻片2次，每次30 min。再于50℃洗液A中，缓慢摇洗玻片2次，每次30 min 继续在室温下，以2×SSC洗玻片2次，毎次5 min。
25. 空气中干燥载玻片。压胶片曝光至少过夜，然后进行乳胶放射自显影。
1. 以上所有步骤均是将承有样品的载玻片置于玻片架中，并在盛有指定溶液的玻璃染色盘中进行，除非另有说明，所有溶液均为新配制，并只使用一次。
2. 碘乙酰胺和N-乙基马来酰亚胺为剧毒物，应小心操作。
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