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PCR法检测支原体

实验方法原理

PCR法的基本原理是酶促DNA合成反应,即在DNA模板、引物和脱氧核糖核酸存在下,经DNA聚合酶的作用,使DNA链扩增延伸。

实验材料 细胞样品
试剂、试剂盒 : dNTP  TapDNA聚合酶  琼脂糖  矿物油  支原体检测试剂盒
仪器、耗材 :超净工作台  PCR仪  电泳仪  凝胶成像分析系统  台式离心机  旋涡混悬器
实验步骤
1. 样品的收集:待测细胞用无双抗培养基培养7d,用无菌容器取上清液500μl,4℃保存待测。
2. 模板的制作:在无菌的条件下,取细胞培养上清液100μl于一无菌的0.5ml塑料离心管内,盖好盖子,95℃水浴加热5min。
3. 打开盖子,向管内加StrataClean树脂10μl,盖好盖子,旋涡混悬器混合,离心5——10s,吸取上清至一新的塑料离心管中,模板制作完毕,4℃保存。
4. PCR反应:
反应体系最适条件为:10mmol/L Tris-HCl(pH 8.38),50mmol/L KCl,1.5——2.5mmol/LMgCl2,200 μmol/L dNTP,2U Taq DNA聚合酶;总反应体系为50μl,反应用去离子水均需用12000μJ/cm2紫外灯照射。
(1)在0.5ml塑料离心管中加入35.2μl去离子水及5μl 10×Taq反应缓冲液。
(2)依次加入下列成分:0.4μl dNTP(25mmol/L);0.4μl Taq酶(5U/μl);2μl引物。
(3)加2μl去离子水,总体积45μl。
(4)加5μl已制成的模板到反应体系中。
(5)阳性对照、内对照各5μl加入到各自的反应体系中。
(6)取1支含有以上反应体系的离心管,加入5μl去离子水作为阴性对照管。
(7)在反应体系中加入100μl矿物油。
(8)PCR程序
程序1:    94℃ 2min、50℃ 2min、72℃ 2min,1个循环;
程序2:    94℃ 1min、50℃ 1min、72℃ 2min,共40个循环。
5. 琼脂糖凝胶电泳:PCR反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶浓度2%。电泳结束后,凝胶成像分析结果。
6. 实验结果及分析:
该方法为检测支原体的定性方法,在电泳泳道上,Marker(DNA分子质量标准参照物)、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带。当被检样品泳道出现明亮条带,且位置在阳性对照和阴性对照条带位置之间,即可认为该样品被支原体污染。有时还会发现一条泳道出现多条,可能是该样品感染2种以上支原体所致。
注意事项
1. PCR反应的前期操作应在无菌环境中进行。
2. 检测前,待测细胞要用无双抗培养基培养7d。
其他
                                                                                                                                                                                                                                                                        来源《细胞生物学实验技术》
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