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细胞凋亡一

     【细胞凋亡技术背景】

      在多细胞生物发育过程中,一些不需要的细胞会以一种自主的方式死亡并被机体清除,这个过程被称为程序性细胞死亡(programmed cell death)。程序性细胞死亡多以细胞凋亡(apoptosis)的机制发生。除细胞凋亡外,细胞死亡还包括坏死(necrosis)和自噬性细胞死亡(autophagic cell death)等多种死亡形式。在细胞坏死初期,胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解,蛋白质颗粒增多,进而细胞质呈现强嗜酸性,经苏木精/伊红染色后胞质呈深伊红色,细胞质膜发生渗漏,DNA降解,细胞内容物释放到胞外,引起周围组织炎症反应。 

      早在20世纪60年代人们就已发现。当细胞在缺乏营养或发生应激反应时,可发生细胞自噬现象,细胞质中形成大量自噬泡,由双层膜包裹着待降解物质。随后,自噬泡与溶酶体融合,待降解物质经酶解后被细胞进一步利用。自噬在细胞的生长、发育和疾病发生中起着重要的作用。近来的研究表明,在某些条件下,细胞自噬也能导致细胞死亡,相应地,细胞凋亡则被称为I型程序性细胞死亡。

凋亡细胞的基本特征主要包括:胞质凝缩,染色质聚集及边缘化,细胞核崩解,细胞以出芽的方式形成凋亡小体,并被邻近的巨噬细胞等吞噬消化。磷脂酰丝氨酸外翻。ƒ凋亡过程中细胞内溶物不被释放,故不会引起炎症反应。④凋亡细胞中仍存在蛋白质的合成反应。⑤内切核酸酶被活化,导致染色质DNA在核小体连接处断裂,形成180~200bp整数倍的核酸片断,凝胶电泳图谱呈梯带状(DNA ladder)等。

细胞凋亡的检测方法主要包括以下几种:细胞径HE、吖啶橙(AO)、Hoechst33342、Hoechst33258染色,利用光境或荧光显微镜对细胞形态学特征进行观测。其中Hoechst33342/PI双标记法是检测细胞凋亡的常规方法。PI是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,由于坏死细胞的膜透性发生改变,则能被PI染色。Hoechst33342是能能够与DNA特异结合的具有良好膜通透性的荧光染料,正常细胞、坏死细胞及凋亡细胞的DNA均可被Hoechst33342染色,当细胞经Hoechst33342/PI双染色后,坏死细胞呈PI强阳性染色(红色),而凋亡细胞或正常细胞呈PI低染,利用荧光显微镜技术结合凋亡细胞核形态的变化就可以将坏死细胞、凋亡细胞和正常细胞区分开来。‚利用DNA凝胶电泳及DNA片段原位标记法(TURNEL assay)检测凋亡细胞DNA的断裂。ƒ利用流式细胞仪检测亚G1期细胞的比例或利用Annexin V、PI联合标记法检测细胞膜磷脂酰丝氨酸翻转,正常活细胞Annexin V、PI均低染;凋亡细胞Annexin V高染、PI低染;坏死细胞PI高染。


【实验方法与步骤】

1)细胞凋亡的诱导:HeLa细胞常规传代培养至对数生长期(见细胞传代培养)。实验组细胞加入顺铂溶液(生理盐水配置)至终浓度为20μmo1/L,37℃,5% CO2条件下继续培养。空白实验对照加入等体积的生理盐水,同样条件继续培养。24h后进行染色及形态学观察。

       (2)胰酶消化细胞,将培养基上清及消化下来的细胞一同转入离心管中600~800r/min离心10min。

       3)吸去上清,用1mL PBS重悬细胞沉淀,并转入1.5mL微量离心管中,600~800r/min离心10min。

       4)吸去上清,用500μL PBS重量细胞沉淀,取178μL转入0.5mL的微量离心管中,加入PI 20μL(终浓度100μg/mL),Hoechest 33342 2μL(终浓度10μg/mL),混匀,37℃温箱中避光标记15min

       5600~800r/min离心10min,弃上清,加50μL PBS重悬细胞。

       6)分别从实验组及对照组中取10μL细胞悬液滴于载玻片上,盖上盖玻片。

       7)荧光显微镜20倍物镜在紫外光激发下观察,可观察到凋亡细胞核形态发生明显的改变,出现染色质凝集及边缘化。

 

      【注意事项】

       1)诱导细胞凋亡后收集细胞时,注意要同时收集细胞培养基上清液。

       2)悬浮细胞时动作要轻柔,避免损伤细胞。

       3)在实验中可同时设计坏死细胞的对照,例如,取正常细胞经低渗后进行染色观察。


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