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蛋白质检测(十五)

凝胶迁移或电泳迁移率实验 实验步骤: 5.洗膜 (1)将封闭液和4倍洗涤液置于37-50℃溶解。 (2)用20ml封闭液封闭尼龙膜,温浴15min,摇船轻摇。 (3)20ml封闭液中加入66.7ul Stabilized S

蛋白质检测(十四)

凝胶迁移或电泳迁移率实验 实验步骤: 1. 探针的标记 探针为含有与蛋白特异性结合的中心盒,大约 20bp 。 2. 非变性电泳 (1) 制备 4% 非变性胶 (2) 制备样品 (3) 电泳:预跑胶

蛋白质检测(十三)

凝胶迁移或电泳迁移率实验 凝胶迁移或电泳迁移率实验( EMSA )是一种研究 DNA 结合蛋白和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。通常将纯化的蛋白或细胞粗

蛋白质检测(十二)

七、蛋白印迹实验常见问题及原因分析 1. 没有带? 原因:样品中抗原含量不足(抗原表达量过低;蛋白降解;上样量不足;样品制备错误);制胶浓度比例不合适;转膜不完全;一抗

蛋白质检测(十一)

蛋白印迹法 六 显色 3. 碱性磷酸酶缓冲液: 100ml 配方如下。 1mol/L Tris-HCL(pH 9.5) 10ml 5mol/L NaCl 2ml 1mol/L MgCl2 0.5ml DDW 87.5ml * 冷藏保存,可保存数月。 4. 显色液 100BCIP 0.1ml 100×NBT 0.1ml * 显色后

蛋白质检测(十)

蛋白印迹法 六 显色 2. AP 标记二抗 显色液配置 ( 1 ) 100 × 氯化硝基四氮唑蓝( NBT ): 10ml 配方如下: NBT 0.33g 70% 二甲基甲酰胺 10ml *1.5ml 离心管分装后冷冻保存,可保存数月。 (

蛋白质检测(九)

蛋白印迹法 六 显色 酶和底物反应显色是蛋白印迹法的最后一步,一般常用酶有 HRP 和 AP ,根据成像底物可分为显色底物和发光底物。发光底物可选用 HRP 标记二抗,显色底物可选用

蛋白质检测(八)

蛋白印迹法 5 实验步骤 (1) 封闭结束后,用 PBS-T 液轻轻清洗膜,去除封闭液。 (2) 用一抗室温孵育 1h 或 4 ℃过夜。 (3) PBS-T 液清洗, 10min ×3 次。 (4) 二抗孵育,室温, 1h 。

蛋白质检测(七)

蛋白印迹法 五 抗原 - 抗体反应 4 二抗的处理 (1) 常用二抗: HRP 偶联二抗。也可用碱性磷酸酶标记二抗,但不够灵敏。 (2) 二抗稀释液: PBS/PBS-T 液、 TBS/TBS-T 液、一般的封闭液等

蛋白质检测(六)

蛋白印迹法 五 抗原 - 抗体反应 1 仪器和设备 塑料盒、振荡器。 2 封闭 一般采用 5% 脱脂奶粉进行封闭,室温, 30-60min 。 * 封闭液的浓度可以是( 1%-5% ),根据自己的条件摸索浓度就可

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