酶联免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与酶促反应的专一性和敏感性结合而形成的一种方法。这是一种固相酶免疫检测技术，始创于1971年。它既可用于测定抗原，又可用于测定抗体。其敏感性高，特异性强，已成为酶免疫技术中应用最广泛的一种方法。本实验以双抗夹心法检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）为例。

【实验目的】

      通过本实验的学习，了解酶联免疫吸附的基本原理及其用途，并熟悉其操作步骤与技能。

【实验原理】

      酶联免疫吸附试验是以免疫学反应为基础，将酶（如辣根过氧化物酶，HRP）标记到抗体或抗原分子上，利用微孔塑料反应板能吸附蛋白质的特性，将可溶性抗原或抗体吸附于反应孔表面，然后用酶标记的抗体或抗原与其特异性结合，洗去游离抗原或抗体，最后加入酶作用底物。由于酶分解底物而显色，根据底物颜色深浅来判断标本中特异性抗原或抗体的量。

【试剂与器材】

      1. 待测抗原、抗体（马抗HBsAg）和酶标记抗体(HRP-抗HBsAg)。

      2. 正常人血清和阳性对照血清。

      3. 包被缓冲液(0.05M  pH9.6碳酸盐缓冲液)。

      Ｎa2CO3     1.59g

      NaHCO3      2.93g

      加蒸馏水至1000ml

      4. 洗涤缓冲液(0.15M  pH7.4  PBS加0.05% Tween-20)。

      5. 底物缓冲液。

      0.1mol/L柠檬酸（2.1g/100ml）6.1ml

      0.2mol/L Na2HPO4·12H2O（7.163g/100ml）6.4mL

      加入12.5ml蒸馏水，将10mgOPD溶于其中，待溶解后，临用前加３０％Ｈ２Ｏ。

      6. 终止液(2M H2SO4）。

      7. 加样器、微孔板、酶标检测仪。

【实验方法与步骤】

      1. 包被：用0.05M pH9.6 碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，于吸水纸上扣干水分。

      2. 加样：加待测抗原0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1h。然后洗涤3次，扣干水分。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

      3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml。37℃ 孵育0.5～1h，洗涤。

      4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的OPD底物溶液0.1ml，37℃ 10～30min。

      5. 终止反应：于各反应孔中加入0.05ml终止液。

       6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可在酶标检测仪上，于492nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

【注意事项】

      1. 试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

      2. 洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性。

【思 考 题】

      1. 在对流免疫电泳中为什么抗体会向阴极移动？

      2. 酶联免疫吸附法有哪几种类型，其原理是什么？

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