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ChIP染色质免疫沉淀技术

染色质免疫沉淀中的对照与抗体选择

抗体选择:  染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时,抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近,不能被抗体识别,所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物,直接影响ChIP的结果。所以不是所有的抗体都能做ChIP实验的,只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。  

阳性与阴性对照:  在做ChIP实验时,一定要做好实验对照,因为没有对照,很难对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体,常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较,才能得出正确结论。另外,还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能,所以通常还会选择一对阴性引物,即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列,作为该抗体的阴性对照。最佳的阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体,只有其他用途的抗体时,可以先做蛋白质免疫沉淀(Immunoprecipitation)检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白,再进行染色质免疫沉淀实验的检测。

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