石蜡切片免疫组化实验
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2018-11-08
链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结SP法
实验方法原理
SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法，是众多免疫组织化学方法的一种。SABC法：一抗+ 生物素标记二抗+ 滴加试剂SABC（链霉卵白素+ 辣根酶标记生物素）+ 辣根酶底物显色。目前常用的亲和素从链霉菌(streptomyces)培养物中提取，因此称为链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物技术(streptavidin biotin-peroxidase complex method，SABC法)。
生物素(biotin)为含硫的杂环单羧酸，分子量小，通过其羧基与蛋白质的氨基结合，从而可标记抗体和酶。亲和素(avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白，在鸡蛋白中被发现，分子量为68 000。生物素与亲和素有很高的亲和力，1个亲和素分子上有4个生物素结合位点。在ABC法中，不对特异性第一抗体进行标记，而用生物素标记第二抗体，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC合物，并使亲和素分子上至少空出1个生物素结合位点。染色时，标本中的抗原先与第一抗体结合，后者再与生物素标记的第二抗体结合，然后加入ABC复合物，结合到第二抗体的生物素上，最终形成的复合物网络了大量的酶分子。因此，敏感性更高。
实验步骤
一、洗载玻片
1. 将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附。
2. 置于清水中清洗，除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4（大约冲一个小时左右）。
3. 将载玻片浸泡于酒精之中， 然后放到架子上，置于37℃温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。
二、包埋组织
1. 在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐。
2. 将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
三、切片
1. 将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致。
2. 调节切片的厚度，一般为5 um，如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40 ℃温水中。
四、捞组织
当组织载玻片置于40 ℃温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37 ℃温箱中烘干。
五、脱蜡
依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放10 min，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间，一般为12-15 min。
六、抗原修复
脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10 min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3 min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
七、血清封闭
冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5 min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37 ℃温箱中半小时。血清稀释10倍（900 ul PBS：100 ul血清封闭液）。
八、加一抗
将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4℃冰箱中保存过夜。
九、加二抗
将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗，然后置于37℃温箱中半小时。
十、加SABC
将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC， 然后置于37℃温箱中半小时。SABC稀释100倍（990ul PBS：10ul SABC）。
十一、加显色剂
将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀） A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液
十二、复染
将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。
十三、脱水
将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
十四、封片
用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
实验方法原理
SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法，是众多免疫组织化学方法的一种。SABC法：一抗+ 生物素标记二抗+ 滴加试剂SABC（链霉卵白素+ 辣根酶标记生物素）+ 辣根酶底物显色。目前常用的亲和素从链霉菌(streptomyces)培养物中提取，因此称为链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物技术(streptavidin biotin-peroxidase complex method，SABC法)。
生物素(biotin)为含硫的杂环单羧酸，分子量小，通过其羧基与蛋白质的氨基结合，从而可标记抗体和酶。亲和素(avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白，在鸡蛋白中被发现，分子量为68 000。生物素与亲和素有很高的亲和力，1个亲和素分子上有4个生物素结合位点。在ABC法中，不对特异性第一抗体进行标记，而用生物素标记第二抗体，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC合物，并使亲和素分子上至少空出1个生物素结合位点。染色时，标本中的抗原先与第一抗体结合，后者再与生物素标记的第二抗体结合，然后加入ABC复合物，结合到第二抗体的生物素上，最终形成的复合物网络了大量的酶分子。因此，敏感性更高。
实验步骤
一、洗载玻片
1. 将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附。
2. 置于清水中清洗，除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4（大约冲一个小时左右）。
3. 将载玻片浸泡于酒精之中， 然后放到架子上，置于37℃温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。
二、包埋组织
1. 在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐。
2. 将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
三、切片
1. 将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致。
2. 调节切片的厚度，一般为5 um，如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40 ℃温水中。
四、捞组织
当组织载玻片置于40 ℃温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37 ℃温箱中烘干。
五、脱蜡
依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放10 min，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间，一般为12-15 min。
六、抗原修复
脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10 min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3 min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
七、血清封闭
冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5 min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37 ℃温箱中半小时。血清稀释10倍（900 ul PBS：100 ul血清封闭液）。
八、加一抗
将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4℃冰箱中保存过夜。
九、加二抗
将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗，然后置于37℃温箱中半小时。
十、加SABC
将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC， 然后置于37℃温箱中半小时。SABC稀释100倍（990ul PBS：10ul SABC）。
十一、加显色剂
将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀） A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液
十二、复染
将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。
十三、脱水
将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
十四、封片
用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
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