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细胞免疫荧光步骤

验方法原理  

在进行细胞免疫荧光过程中,需要用到细胞爬片,通过将爬片浸在细胞培养基内,细胞在爬片上生长,进而进行细胞的免疫荧光。

实验材料 细胞样品

试剂、试剂盒 : 多聚甲醛  70%甲醇  丙酮  PBS  Triton   BSA  DAPI染液  DABCO  Tris  甘油
仪器、耗材: 玻片
实验步骤
细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天:
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次,每次3min;
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min, PBS浸洗玻片3次,每次3min;
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤);
4. PBS浸洗玻片3次,每次3 min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室温封闭30min;
5. 吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒,4℃孵育过夜;
第二天:
6. 加荧光二抗: PBST 浸洗爬片3次,每次3min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中20-37℃孵育1h,PBST浸洗切片3次,每次3min;注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核:滴加DAPI避光孵育5min,对标本进行染核,PBST 5minx4次洗去多余的DAPI;8. 用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察采集图像。
注意事项
1.取细胞爬片时,动作应轻柔,防止将细胞爬片夹碎,影响实验进程。
2.种细胞过程中,要注意将细胞轻柔混匀,“八”字或者“十”字形摇晃,防止细胞局部生长过密。
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