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蛋白质保存套路,你知多少?


  蛋白质的保存是一个比较棘手的问题,分子生物学实验室的童鞋们或多或少都会碰到。

  有没有遇到过,不同批次纯化的蛋白,采用同样的测试方法,活性却不太一样?

  有没有遇到过新纯化的蛋白,从冰箱拿出融化后,居然沉淀了?

  蛋白质纯化后,保存方式都有哪些呢?下面花三分钟,中洪博元和你聊一聊纯化后蛋白的保存问题。

一、谨记蛋白质的保存原则

  低温、分装、浓缩、速冻/速融、添加剂

二、保存方法你知多少

  蛋白质的的保存方法的选择完全取决于蛋白质的稳定性以及保存后什么时候再次使用你的蛋白。

  1、如即提即用的话,可将浓缩蛋白质储存在单一溶液(如PBS),置于聚丙烯管或干净的玻璃容器中,放在4°C冰箱保存。

  优点:蛋白容易获得,可以快速进行实验,且同一管样品可重复取样,这样避免了因经常解冻而加速蛋白的降解。

  缺点:可能会面临微生物污染,蛋白质失活和氧化,可能对实验数据的均一性造成影响。要避免这种情况,可以把蛋白质分成小份储存,并加入蛋白酶抑制剂、抗菌剂和还原剂等。但也要根据自己蛋白的情况,如果你的蛋白是完整的膜蛋白或分泌蛋白,很可能分子内存在二硫键,为保证其完整性,应该存储在氧化环境中。另外,储存时间超过一个月的蛋白可以考虑扔掉。

  2、透析到合适的缓冲液中可以冻干,放4°保存;也可加高浓度的硫酸铵(你的蛋白不沉淀的话),4°保存。

  注意:你要注意加入硫酸铵后pH会下降一些,你的缓冲液可不能太接近蛋白的等电点啊,蛋白在等电点附近沉淀很多时候是不可复溶,即使复溶活性也不能保证。

  3、纯化后的蛋白测浓度后,加入50%甘油,确认混匀后分装,液氮速冻,放入-20度或-80度保存,尤其适用于酶类。


  优点:在低温下,蛋白质对微生物污染,蛋白酶降解和氧化反应更有抵抗力,容易保证其活性。用甘油或乙二醇稀释使蛋白处于溶液中,可以方便取样。此外,这种方式储存的蛋白质可以保存长达一年,对于抗体轭合物是一个好的选择。

  缺点: 蛋白质在-20°溶液中仍有可能遭受水解、污染和氧化,如果蛋白对还原性环境要求比较高,也需加入抑制剂、还原剂等。而且将样品存放在50%冷冻保护剂中有时是不可取的,取决于你接下来要做的实验。

  4、有些蛋白可以不加甘油,直接液氮速冻几分钟,-80度保存。

  优点:可以长期保存(多年),不需要甘油、叠氮化钠等化学物质,避免蛋白质降解或微生物污染。

  缺点:冷冻蛋白质应一次性使用,为了避免反复冻融发生降解。此外,抗体轭合物(特别是碱性磷酸酶复合物)冷冻后可能会失活。

  5、长期保存蛋白质的另一个方式是冻干(lyophilization)。

  优点:蛋白质冻干后会呈现蓬松的白色粉末形式,处于完全脱水的状态,可以在冰箱中无限期保存。

  缺点:对于某些蛋白质,冻干操作有一个潜在问题就是蛋白质不能复溶。冻干/复溶的过程同样会对蛋白质产生一定的伤害作用。


三、这些重点你要知道

  1、 保证恒定的pH值,一般PBS最为常用;

  2、保证一定的蛋白浓度,如果浓度比较稀的话,可以考虑添加一定量的BSA;

  3、甘油的添加也能在很大程度上提高抗体的稳定性;

  4. 为了防腐可以添加一定量的叠氮化钠(辣根过氧化物酶偶联的二抗一般不能加),如果样品要用于生物学检测,避免使用防腐剂。

  5、无论是冷冻还是储存在溶液中,将蛋白进行分装,以避免冻融,降低污染的风险。

  6、进行蛋白质操作实验时一定要带手套,们的皮肤上有一些蛋白酶,这些蛋白酶很可能会降解掉我们的蛋白样品。皮肤上的其他化学分子也可能会污染蛋白样品。另外,为了防止细菌的生长,蛋白质最好保存在灭菌的小管中。

  7、避免反复冻融或冻干重溶解过程,这样很可能会降低生物活性。

  8、避免震荡,震荡产生的剪切力有可能会对蛋白质产生破坏作用。震荡时溶液中会产生气泡,氧气的进入会导致蛋白质处在氧化环境中。蛋白质中含有半胱氨酸,其极易被氧化为胱氨酸,这一过程很可能会破环蛋白质的活性。
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