一、实验材料及仪器：

    1.实验动物：小鼠

    2.0.8m g / m l B r d U (Sigma) 水 溶 液（口 服用）或 4m g / m l B r d U P B S 溶 液（注射用)

    3.PBS ，pH 7.4

    4.0.15mo l / L 冰冷的 NaCl

    5.冰冷 的 95 % 乙醇

    6.多聚甲醛固定液

    7.DNA 酶 I 溶液

    8.抗 B r d U - F I T C (Becton Dickinson Immimocytometry)

    9.15m m X 75m m 圆底聚苯乙烯管

    10.能进行三色或四色分析的流式细胞仪

    二、实验步骤：

    1.通 过 饮 水（将 0 .8m g / m l B r d U 溶解在无菌饮用水中；因 B r d U 对光敏感，因此需每天更换新配的水溶液）给 予 B r d U ，或采用静脉或腹腔注射 B r d U 浓 度 为 4m g / m l 的P B S 溶液，按附录 2E 中的方法每只小鼠注射 0.2 ml (0.8m g )。 如果需要准确计算初始给药时间，可同时通过注射和饮水给予 B r d U 。

    2.取淋巴器官制备单细胞悬液（单 元 2.1)。 对细胞进行免疫荧光检测（单 元 4.1)。 如细胞已在微孔板中完成表面标记，将细胞转移到 15m m X 75m m 试管中。

    3.采用合适的抗体和荧光素对细胞进行表面标记。如 果 采 用 本 方 案 推 荐 的 抗 B r d U -F I T C 抗体，那么表面标记不要使用 F T T C 交联抗体。

    4.加 入 Iml P B S ， 4°C ， 300 g离心 6 min。丢弃全部上清后用 0.5m l 冰 冷 的 0. 15mol/LN a C r 混悬细胞。如采用碘化丙锭区分活细胞和死细胞（单 元 4.1)，那么在固定和打孔 之 前 再 洗（步 骤 4〜5) 4 或 5 遍以去除所有细胞外的碘化丙锭。

    5.轻轻振荡细胞，同时逐滴加入 1.2m l 冰 冷 的 9 5 % 乙醇以避免细胞聚团。冰 浴 30m i n 。加入 2 ml P B S ， 4°C ， 450 g•离心 6m i n 。

    6.彻底弃上清。用 I m l 多聚甲 醛 固 定 液 混 悬 细 胞 。室 温 放 置 30 min， 4°C ， 离心 6 min

    7.弃上清。用 l m l D N A 酶 I 溶液混悬细胞。室 温 放 置 10m i n 。加 入 2 m l P B S ， 4°C ，450 g 离心 6m i n

    8.弃上清。混 悬 细 胞 后 加 入 10M 1 抗 B r d U -F I T C 抗 体 ，室 温 孵 育 30m i n 。加 入 2 mlP B S ， 4°C ， 450 g 离心 6m i n 。

    9.用 500M1 P B S 混悬细胞。立即进行流式细胞分析（单 元 4 . 2 ) 或 者 4°C 避光保存不超过一周。

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