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微生物鉴定中常用的生化反应

实验原理

     有些细菌具有合成淀粉酶的能力,可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖,淀粉水解后遇碘不再变蓝色。

细菌产生的脂肪酶能分解培养基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。脂肪酸可以使培养基pH下降,可通过在油脂培养基中加入中性红做指示剂进行测试。中性红指示范围为pH6.8(红)~8.0(黄)。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时,则菌落周围培养基中出现红色斑点。

某些细菌分泌蛋白酶分解明胶,产生小分子物质。如果细菌具有分解明胶的能力,则培养基可由原来固体状态变成液体状态。

牛乳中主要含有乳糖、酪蛋白等成分。细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊中性时呈淡紫色,酸性时呈红色,碱性时呈蓝色,还原时则部分或全部脱色。细菌对牛乳的利用可分三种情况:

(1)酸凝固作用:细菌发酵乳糖后,产生许多酸,使石蕊牛乳变红,当酸度很高时,可使牛乳凝固,此称为酸凝固。

(2)凝乳酶凝固作用:某些细菌能分泌凝乳酶,使牛乳中的酪蛋白凝固,这种凝固在中性环境中发生。通常这种细菌还具有水解蛋白质的能力,因而产生氨等碱性物质,使石蕊变蓝。

(3)胨化作用:酪蛋白被水解,使牛乳变成清亮透明的液体。胨化作用可以在酸性条件下或碱性条件下进行,一般石蕊色素被还原褪色。

实验材料

1、活材料:大肠杆菌(E. coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、黏乳产碱杆菌(Alcaligenes viscolactis)、铜绿假单胞菌(Psudomonas aeruginosa)、普通变形杆菌(Proteus vularis )。

2、培养基:淀粉培养基:牛肉膏蛋白胨培养基加0.2%的可溶性淀粉;油脂培养基:牛肉膏蛋白胨培养基加花生油10mL、0.6%中性红水溶液1mL;明胶液化培养基:蛋白胨5g,明胶100~150g,水1000mL, pH7.2~7.4,115℃灭菌20min。石蕊牛乳培养基:牛奶粉100g、石蕊0.075g、水1000 mL、pH6.8,121℃灭菌15 min 。

3、试剂:卢哥氏碘液。

实验用品

平皿、接种环、酒精灯、试管、接种针等。

实验方法

(一)淀粉水解试验

1、准备淀粉培养基平板:将熔化后冷却至50℃左右的淀粉培养基倒入无菌平皿中,待凝固后制成平板。

2、接种:用记号笔在平板底部划成两部分,在每部分分别写上菌名,用接种环取少量的待测菌,点接在培养基表面的相对应部分的中心,其中一个菌种应是枯草杆菌做对照菌。★你能解释原因吗?

3、培养:将接种后的平皿置于28℃恒温箱培养24h。

4、检测:取出平板,打开平皿盖,滴加少量的碘液于平板上,轻轻旋转,使碘液均匀铺满整个平板。菌落周围如出现无色透明圈,则说明淀粉已经被水解,表示该细菌具有分解淀粉的能力。可以用透明圈大小说明测试菌株水解淀粉能力的强弱。

(二)油脂水解试验

1、将装有油脂培养基的三角瓶置于沸水浴中熔化,取出并充分振荡,使油脂均匀分布,再倾入无菌平皿中,待凝固成平板。

2、接种:于同一平皿的两边接种,其中一种是金黄色葡萄球菌作为对照菌。置于37℃恒温箱培养24h,取出后观察平板菌苔颜色,如果出现红色斑点,即说明脂肪被水解了,此反应为正反应。红色斑点大小说明测试菌株水解脂肪能力的强弱。

(三)明胶液化试验

1、接种:用穿刺接种法接种大肠杆菌或产气肠杆菌于明胶培养基中。

2、培养:放20℃恒温箱中培养48h。若细菌在20℃下不长,则应放在最适温度下培养。

3、观察结果:观察培养基有无液化情况及液化后的形状。

因明胶在低于20℃时凝固,高于25℃时自行液化,若是在高于20℃下培养的细菌,观察时应放在冰浴中观察,若明胶被细菌液化,即使在低温下明胶也不会再凝固。

(四)石蕊牛乳试验

1、接种:将黏乳产碱杆菌和铜绿假单胞菌接种入石蕊牛乳培养基中。

2、培养:将接种后的试管于37℃恒温培养7d,另外保留一支不接种的石蕊牛乳培养基作为对照。

3、结果观察:取出培养物,以不接种任何细菌的试管为对照,观察接种不同细菌生长后的变化情况


                                                                                                                                              此文转载:丁香通

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