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慢病毒生产方案
一、材料和试剂
1.  Hairpin-pLKO.1vector(OpenBiosystems)
 
2.  Packagingvectors:第二代包装质粒包含gag,pol,和rev基因(pCMV-dR8.91或pCMV-dR8.74psPAX2)和包被质粒(pMD2.G)(Addgene)
 
3.  脂质体2000(Invitrogen)
 
4.OptiMEM无血清培养基(Invitrogen)
 
5.  293T包装细胞(ATCC)
 
6.  DMEM(Invitrogen)
 
7.  胎牛血清(Invitrogen)
 
8.  青/链霉素(Invitrogen)
 
9.  6 cm 细胞培养皿(Fisher)
 
10.  45 um 过滤器(Fisher)
 
 
二、仪器
1.  细胞培养箱
 
2.  离心机
 
 
三、实验步骤
1.  6 cm 细胞培养皿中种植293T细胞,细胞密度为1.3~1.5×105,每孔体积6 ml。
 
2.  孵育细胞24 h(37℃,5%CO2),或者孵育至第二天下午。约24 h 后,细胞融合度应该达到了70%。
 
3.  转染包装细胞:
(1)准备含有3种转染质粒的混合物
900 ng 包装质粒
100 ng 包被质粒
1 ug pLKO.1质粒
10~30 ul OptiMEM培养基

(2)用OptiMEM稀释脂质体2000:10 ul 脂质体+90 ul OptiMEM。逐滴滴加脂质体试剂,通过颠倒旋转或者轻弹管子来混匀,(不能用移液器或者涡旋来混匀),室温下孵育5分钟。
 
(3)向稀释的脂质体中逐滴滴加上述3种质粒混合物,颠倒旋转或者轻弹管子混匀。
 
(4)室温下孵育转染混合物20~30分钟。
 
(5)小心将转染混合物移入包装细胞的培养液中。包装细胞对外源干扰非常敏感-小心不要让细胞从板上脱落。每板需要转染混合物的总体积为100~125 μL。
 
4.  孵育细胞18 h(37℃,5%CO2),或者直到第二天早上。
 
5.  更换培养液以去除转染试剂,为了进行病毒收获更替为6 mL 的收获培养液。
 
6.  孵育细胞24 h(37℃,5%CO2)。
 
7.  在转染约40 h 后收集含有慢病毒的培养液。将培养液移入储存管中。替换为6 mL 的收获培养液。
 
8.  每12~24 h 重复上述病毒收获过程,并且替换为6 mL 的收获培养液。病毒滴度在收获过程中会逐渐的减弱;通常总共收集2~3个时间点的病毒。最后一次收获之后,丢弃包装细胞。病毒收获物可以按需要进行合并。
 
9.  1250 rpm 的转速旋转包含病毒的培养液5分钟,使得在收获过程中所收集的包装细胞变成球状。将上清液通过45 um 过滤器,然后移入无菌储存管中。
 

10.  病毒在4℃可以保存时间较短(数小时到数天),但是在-20℃或在-80℃可以冻存较长时间。为了减少冻结/解冻的次数,在长期储存之前,需将大量的病毒产品分装入小的储存管中。


                                                                                                                                                                                                                                             此文转载:丁香通

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