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动物细胞转染技术


  1.将HeLa细胞2×105个接种于35mm培养皿中,培养基为10%FBS的DMEM,37℃,5%CO2培养箱条件培养。

  2.对GFP质粒进行除菌处理和浓度测定,可采用无水乙醇沉淀GFP质粒,再用70%的乙醇洗1或2次,将沉淀的质粒溶于灭菌的TE中,然后用紫外粉光关都系测出质粒的准确浓度,质粒的浓度(μg/ml)=OD260值×50μg/ml×稀释倍数。
  3.当细胞融合约为80%时,开始进行转染处理。在一个1.5ml的EP管中,加入100μl无血清DMEM培养基,取2ugGFP质粒DNA溶解其中;在另一个1.5mlEP管中,加入100ul无血清DMEM培养基,取6-8ul脂质体转染剂稀释于其中,再将两管溶液混合均匀,室温下放置20min。
  4.用2ml无血清DMEM培养基漂洗细胞2遍,向质粒DNA与脂质体转染剂的混合液加入0.8ml无血清DMEM培养基并混匀,然后加到漂洗过的细胞上。
  5.将细胞放入培养箱培养3-8h,然后加入1ml含20%FBS的DMEM培养基继续培养。
  6.培养24h后,将培养基吸出,加入2ml含10%FBS的DMEM培养基,37℃,5%CO2培养箱培养。
  7.在荧光显微镜下实时观察细胞,表达GFP的细胞在蓝光激发下可呈现绿色荧光。
  注意事项:
  1.注意细胞的生长状态,最适合转染的细胞是达到指数生长期生长旺盛的细胞。
  2.实验前进行预试验确定适当的接种量和培养时间。

  3.DNA若不纯,会严重影响转染效率。


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