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原代培养操作

  (1)取怀孕14~20d的母鼠,断颈处死,固定在解剖台上,用2%碘酒和75%酒精棉球消毒腹部皮肤。无菌条件下,用大手术剪将皮毛层从胸骨柄下部剪到耻骨联合。换用小直剪剪开腹肌,剖开腹腔,暴露子宫。

  (2)用镊子将子宫提起,眼科剪依次剪断子宫系膜,分离出子宫。剪断子宫角,取出整个子宫,在无菌滤纸上吸干血迹。置于盛有Hanks的培养皿内。用Hanks洗涤子宫表面,弃除表面残余血迹。

  (3)纵向剪开子宫,取出带有胎膜的胚胎,置于另一盛有Hanks的培养皿内,充分洗涤,弃除表面的血迹。剪开胎膜,取出胎鼠,弃除胎膜。用Hanks洗涤3次。

  (4)剪去胚胎头部、四肢、除去内脏。将躯干部置于另一盛有Hanks液的培养皿内。用Hanks洗涤3次,匆留任何血迹。

  (5)用弯头剪把胚胎躯干尽量剪碎,每个组织块小于1mm3大小。在操作时应尽量将平皿盖半盖住平皿以防空气中尘埃落下污染组织。再用Hanks液洗涤2或3次,清洗后使组织块自然沉淀。用吸管吸去上清液。以下可按两种方法进行。即消化法和组织块培养法。

  (6)若使用消化法,则将组织块放入一无菌三角瓶内。三角瓶内预置一个磁力搅棒。加入10~30mL的0.125%的胰蛋白酶。37℃磁棒搅拌消化20min以上。加入少量血清终止消化过程。用几层无菌纱布过滤。取过滤液,800r/min离心5~10min收集细胞。弃上清,加入带有双抗的培养基,放入培养瓶培养。

  (7)若进行组织块培养,则不做步骤(6),加入几滴血清于组织块中,再用弯头吸管将组织块悬液吸起。在一小方瓶中逐个铺展开,注意将瓶底涂抹均匀。将瓶子翻转倒置后在37℃培养箱内放置2~3h。待组织块微干与瓶壁粘牢后再轻轻将瓶子翻转过来,从边角加入4~5mL培养基,使细胞接触到培养液。放培养箱内继续进行培养。


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