摘要：心肌梗死后心脏修复研究发现心肌细胞增殖是限制成年哺乳动物心脏再生的主要因素。然而，越来越多的证据表明，对这一种细胞类型的狭隘关注，使涉及一整套不同细胞类型的复杂级联细胞通讯的重要性大打折扣。研究心脏再生的一个主要困难是在成年动物中这种过程非常罕见。我们将成年斑马鱼作为理想且独特的模型进行了综述，在该模型中，研究了心脏损伤后实现完全心脏再生所需的潜在机制和细胞类型。我们介绍了心脏微环境在复杂再生过程中的作用，并讨论了使用这种体内脊椎动物模型的一些关键进展，这些进展最近增加了我们对多种不同细胞类型的重要作用的认识。由于大量令人兴奋的研究描述了炎症细胞在心脏再生中的新的和意想不到的作用，本综述将特别关注这些重要的微环境参与者。

简介：心血管疾病和心肌梗塞（MI）仍然是全球主要的健康负担，并且它们与肥胖症的流行和日益不健康的生活方式之间的关系意味着在未来几年内其发病率不太可能下降。心肌梗死通常继发于冠心病，可导致大量心肌细胞（CM）丢失，可能高达10亿个细胞，随后常伴有纤维化组织和瘢痕形成，严重限制心脏的功能能力，导致心力衰竭。哺乳动物模型的再生仅限于早期发育阶段。当前针对心血管疾病的治疗选择范围从药物到移植。 但是，不可避免的是，每种策略都具有相关的缺点。长期以来，通过干细胞或细胞替代疗法来刺激新CMs的产生一直是最终目标。以CM为中心的疗法取得的成功有限，这些方法过于狭窄，过于专注于单一细胞类型。为了开发一种可能刺激内源性再生或为CM替代策略提供额外支持的方法，还必须利用一个促进再生的微环境，扩大范围，包括各种非心肌细胞和细胞外环境。为了研究这种复杂性，似乎有必要求助于一个既能提供自然再生能力又能提供完整体内系统的模型系统，斑马鱼可以（几乎唯一）满足这些标准。心室顶点的外科切除术已经使用了近二十年，以研究与成年斑马鱼心脏组织再生有关的机制。此外，遗传细胞消融模型已被用于减少CM数量并触发再生。最近，冷冻损伤模型的开发将液氮冷却的探针放置在心室上以诱导局部细胞死亡，从而提供了一个新的视角来观察所得的再生，并更能代表由MI引起的细胞损伤。无论选择哪种损伤模型，对该模型中复杂损伤反应的研究都提供了有关损伤后重建心脏所需的细胞和分子机制的大量信息，并且越来越强调需要将范围从CM扩展到这些细胞周围的微环境。

目前的治疗前景：尽管成年哺乳动物心脏的结构相对简单，但修复是复杂的，而且迄今为止还无法实现再生。由于目前再生是不可能的，而且心脏移植也受到实际考虑的限制（不仅缺乏供体，而且还有相关的手术复杂性），重点是治疗而不是治愈，特别是防止缺血性心脏病发展为心力衰竭。心脏保护性治疗方案可以改善血液供应（例如通过溶栓或旁路手术进行血运重建），而药理学干预措施可以减慢心脏重塑（例如ACE抑制剂和β受体阻滞剂），而更晚期的心力衰竭患者受益于机械支持疗法（如左心室辅助装置或心脏再同步治疗）。尽管治疗干预措施广泛，但缺血性心力衰竭及其相关的不良心脏重塑仍然是全球卫生服务的主要挑战。细胞置换疗法旨在直接解决CM增殖不足的问题，而CM增殖被广泛认为是心脏再生的限制因素。这些治疗方法包括在体外培养大量的细胞，并将它们直接注射到受伤的心脏中，在许多临床前环境中显示出了希望。然而，这一相对较新的策略的结果往往不一致，无法实现心功能的显著改善，动物模型的研究揭示了令人担忧的普遍副作用，包括心律失常和心动过速。研究发现，直接化学刺激固有免疫系统产生的结果可与先前报道的心脏缺血损伤修复性细胞疗法相媲美。干细胞疗法产生的有益效果主要是由特定巨噬细胞群体的急性区域积累和由细胞移植引发的炎症性伤口愈合反应介导的，而不是由移植细胞的直接增殖介导的。这些发现也与一种新的研究趋势相一致，进一步阐明免疫反应在心脏修复和再生中的作用。

心肌细胞增殖：近年来，CMs增殖能力不足已成为心脏损伤/心肌梗死后心脏再生的主要限制因素。在成熟哺乳动物心脏中，CM增殖不良，祖细胞数量较少，出生后心脏主要通过心肌肥大而增大。考虑到其再生潜力，成人心肌的组成值得注意。尽管约90%的心肌组织由CMs组成，但这些细胞仅占细胞总数的30%，其余主要由内皮细胞（43%）、成纤维细胞（20%）和白细胞（约7%）组成。大约1％是CM祖细胞（或干细胞），再加上大多数成年CM处于静止状态这一事实，被认为是造成成年人类心脏损伤后再生能力非常低的事实。考虑到心肌梗死后的细胞损伤可能在25％的细胞损失范围内，很明显，正常的周转和置换操作存在明显的缺陷，并且不足以恢复梗死后的功能性心肌。然而，如果心肌细胞总数中只有30%是CMs，那么将我们对再生能力的关注范围缩小到这种单细胞类型似乎是有限制的。尽管在成年哺乳动物的心脏中不存在强健的再生，但是在新生哺乳动物中观察到了不同程度的心脏再生。 鼠和猪的心脏能够有效再生，前提是损伤发生在出生后的前两天，并且损伤程度不会太大（<15％）。损伤导致高达20%的心室细胞死亡（按面积计算）似乎可以很好地耐受并在伤后60天内完全消除，但将损伤面积增加5%似乎会使斑马鱼心脏的再生能力超出其极限，即使在130 dpi时疤痕也无法完全消除。此外，最近的一份报告表明，反复的冷冻损伤限制了成年斑马鱼的再生能力。有趣的是，每次损伤后CM增殖都会被激活（尽管随着时间的推移，这种增殖效率会降低），但是每次损伤都会加剧胶原沉积，疤痕清除逐渐失败，这进一步表明再生能力有限。斑马鱼损伤模型还有助于在再生环境中阐明新的心肌细胞来源。 数项研究已利用谱系追踪方法显示现有成熟的CM是新心肌的来源，而干/祖细胞在此过程中没有明显参与。从形态学上看，分裂的斑马鱼CMs以类似于促进小鼠细胞增殖的结构改变的方式改变其收缩状态。在成年哺乳动物中有一些CM增殖，这可能是由现有的CMs引起的（如斑马鱼）；然而，这种情况发生的频率要低得多，而保持这种增殖能力的CMs的特征尚未完全确定。近年来有证据表明倍性是一个重要因素。大多数斑马鱼细胞质雄性不育系是单核和二倍体的；然而，这些特性在哺乳动物细胞中丢失，这些细胞在出生后不久就变成双核或多倍体。这一假设关系得到进一步证实，因为单核二倍体CMs的患病率已被证明与小鼠冠状动脉结扎后的功能恢复和CM增殖相关，CM倍体通常可以预测脊椎动物的再生潜力。Gonzalez-Rosa等人的 最近研究已经显示了倍性的重要性，因为斑马鱼雄性不育系的实验性多倍体化足以抑制这种高度再生模型中的增殖潜能，并且需要大量的二倍体CM来支持再生。

斑马鱼作为修复与再生的模型：斑马鱼的许多优点，如其高繁殖力、外部受精和发育中幼虫的透明性，是将其作为脊椎动物发育生物学的一个有价值的模型系统的基础。然而，编码人类基因的70%与斑马鱼中发现的基因有关，84%的疾病相关基因具有斑马鱼的等效性，这意味着它们已经成为人类疾病的重要模型。除了这些众所周知的特征外，斑马鱼在本研究中的关键属性是它们几乎具有独特的能力，能够在损伤后完全再生成年心脏，从而为从修复到再生的过程提供细胞和分子图谱。如上所述，已在成年斑马鱼中描述了三种主要的心脏损伤模型：（1）心脏切除，（2）冷冻损伤和（3）CM的遗传消融。值得注意的是，在心脏损伤之后，如心肌梗死（人类）或冷冻损伤（斑马鱼），从损伤到修复和瘢痕形成的初始阶段都是保守的，这进一步加强了斑马鱼作为一种强有力的工具的价值，以了解阻止哺乳动物再生的限制因素。人类和斑马鱼的修复都涉及一个初始的炎症阶段（定义为免疫细胞的募集和吞噬作用清除细胞碎片），然后是修复阶段，其特征是胶原蛋白和其他细胞外基质（ECM）成分的沉积以及疤痕的形成。在人体中，这种胶原蛋白基质会形成无法消除的成熟疤痕。 但是，在斑马鱼中，废弃的胶原蛋白会迅速重塑并被新的心肌所取代。

人和斑马鱼心脏修复。人类和斑马鱼心脏损伤后的修复/再生阶段，表明最初的炎症反应和疤痕反应相似，但最后阶段有所不同，人类表现出持续性瘢痕组织和CMs更新不良。斑马鱼心肌梗死模型（如图中所示的冷冻损伤）表现出瘢痕愈合和CM增殖的再生阶段，最终恢复健康心肌。

冷冻损伤导致心室壁细胞死亡（冠状动脉管腔中也可检测到凋亡细胞），其峰值约为4dpi，在60 dpi时逐渐降低至0.5%以下。这个凋亡高峰伴随着最初的炎症反应和新生血管的开始，同时已有的冠状动脉血管萌芽进入损伤区域。在4 dpi时也可以看到损伤区域广泛的纤维蛋白积聚，但在14-21 dpi时大部分消失。在损伤反应的最初阶段观察到广泛的CM（和其他细胞）增殖，在第一周达到高峰。到21dpi时，损伤区域的血管覆盖已经完成，并且损伤区域的血管重建非常迅速，以至于仅仅在受伤后40天，对照组和受伤心脏之间的血管就无法区分。富含胶原蛋白的疤痕的沉积、重塑和成熟是哺乳动物修复过程中的最后阶段；然而，斑马鱼体内该组织的溶解速度很快，心脏组织的瘢痕清除和再生在60-130 dpi内完成，这取决于初始损伤的大小。有趣的是，冷冻损伤和切除损伤反应的对比分析表明细胞凋亡、炎症和疤痕的程度不同，进一步突出了损伤之间的差异。成人体内系统的这种再生能力为研究完整环境中再生的分子和细胞过程提供了无与伦比的机会。

最近，人们开始将注意力集中在炎症作为再生过程的关键方面。 斑马鱼具有许多与哺乳动物相似的先天性和适应性免疫细胞群，在健康且受伤的斑马鱼心脏中可以发现相似的比例。我们的小组和其他人已经描述了先天性和适应性免疫细胞群的系统性招募和扩张，并且已经开始揭示它们在成年斑马鱼心脏修复和再生时间表的特征阶段中的作用。这表明斑马鱼和哺乳动物心脏修复之间存在直接的相似性，及时诱导和消除炎症反应对于斑马鱼心脏的正常再生和调节修复的许多其他方面至关重要，包括血运重建，CM增殖与瘢痕沉积及消退。最近的观察也表明，如果没有严格的炎症反应调节，无论是否存在增殖细胞和ECM，过度的免疫细胞聚集都会抑制再生。这表明炎性细胞在耦合CM增殖和瘢痕消除中起关键作用，这两者对于有效的再生结果至关重要。全面描述斑马鱼和哺乳动物在修复和再生过程中的免疫细胞类型，以及全面了解斑马鱼和哺乳动物之间的差异，对于理解它们在损伤后的不同作用至关重要。在这里，我们介绍了在心脏再生过程中已研究的主要免疫细胞类型。

粒细胞：粒细胞是先天免疫系统的关键组成部分，包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，已开始明确它们在成年斑马鱼心脏损伤后的作用和动态。中性粒细胞是组织损伤的“第一反应者”，从伤后6小时（hpi）起迅速动员和招募到低温损伤的心脏中。中性粒细胞数量在最初的24小时内达到高峰，在此期间它们是促进炎症修复的主要因素。除了对坏死组织的吞噬作用外，被招募的中性粒细胞还分泌促炎介质、活性氧（ROS）和细胞因子，这些物质招募额外的免疫细胞，促进肌成纤维细胞分化和血管生成，对后期再生至关重要。然而，中性粒细胞释放ROS，以及浸润的单核细胞，会导致进一步的组织坏死和瘢痕形成。在心脏损伤模型中，中性粒细胞滞留可延长炎症期，导致瘢痕消退延迟和CM增殖减少，因此，及时停止中性粒细胞反应对斑马鱼再生结果至关重要。嗜酸性粒细胞也会迅速聚集到受伤的斑马鱼心脏中，并从7-21dpi升高，尽管如此，尚未对斑马鱼中的这种细胞类型进行功能研究，因此需要进一步研究以阐明它们在协调修复和再生中的作用。

巨噬细胞：不同巨噬细胞功能在伤口愈合过程中的重要性已经在修复性和再生性生物体中得到了很好的描述。这包括修复初期的吞噬和促炎活性，以及炎症环境向稳态状态的逆转。巨噬细胞的功能范围也在不断扩大，最近的出版物确定了鼠和斑马鱼模型中巨噬细胞在伤口血管生成，心脏稳态期间的电导率以及心脏损伤后胶原沉积中的新作用。巨噬细胞按功能和激活状态大致分为“ M1”或“ M2”，M1巨噬细胞被认为是促炎和抗微生物的，M2巨噬细胞被认为在促进修复的，在组织重建、免疫调节、基质沉积和吞噬作用中发挥作用。然而，越来越明显的是，心脏巨噬细胞的多样性，有时甚至令人惊讶的作用是由高度异质的表型、转录谱和激活状态的亚群所协调的，这些亚群比传统的M1或M2分类更具瞬时性。

淋巴细胞：适应性免疫系统与再生之间的关系一直是争论的焦点，因为拥有更先进免疫系统的有机体通常会降低再生能力。因此，中性粒细胞和巨噬细胞在伤口愈合和再生中的作用已经得到广泛研究，但适应性免疫细胞的作用却不太清楚，特别是在心脏再生方面。然而，越来越明显的是，许多再生生物，包括斑马鱼，拥有复杂的适应性免疫系统，这就证明了在再生过程中研究这些细胞的必要性。适应性免疫系统的淋巴细胞，如T细胞，协调抗原特异性免疫。T细胞有许多亚群，具有不同的功能，如肿瘤和病毒免疫、细胞因子分泌和体液反应的建立。另一个亚群，CD4+ FOXP3+ T调节细胞（Tregs）对于通过分泌抗炎细胞因子如IL-10来抑制炎症反应很重要。在小鼠心肌梗死模型中，这些T细胞群已被证明具有不同且相反的作用，在伤口愈合、炎症和CM数量调节方面具有已知的功能。因此，有必要进一步研究T细胞对心脏损伤的反应。

细胞外基质的组成和功能：尚未解决的成熟疤痕的形成主要抑制了哺乳动物心梗后的心脏功能，因此，ECM的组成和调节其的细胞也应被视为再生过程中的重要角色。心肌细胞外基质（ECM）是一个复杂的蛋白质网络，主要由胶原组成，有一个围绕CMs（肌内肌层）的组织，定义主要的心肌组织束（肌膜）并包裹整个心肌。它环绕心脏，提供支架并维持组织结构。在哺乳动物和斑马鱼中，心脏成纤维细胞是产生ECM的主要贡献细胞类型。正常情况下，间质成纤维细胞对损伤或缺氧等刺激反应迅速，重新进入细胞周期，合成ECM蛋白，调节细胞间通讯，产生活化的成纤维细胞和肌成纤维细胞。在哺乳动物中，心脏ECM被认为主要由胶原蛋白I（> 85％）组成，其他胶原蛋白，纤连蛋白，糖胺聚糖（GAG）和蛋白聚糖构成了其余的基质。有关ECM组成的其他信息可从免疫检测分析中获得，这些检测结果表明斑马鱼心脏再生过程中存在几种基质蛋白，包括结构蛋白，例如非原纤维胶原XII和原纤维胶原I。斑马鱼的去细胞化心肌细胞外基质对人心脏前体细胞具有显著的增殖作用，并能使心肌梗死后小鼠心脏组织内源性再生。斑马鱼和哺乳动物细胞外基质的这些明显差异突出了其在介导再生中的重要性，并证明了继续研究ECM成分产生和分解的确切方式的价值。

结论：本文综述了斑马鱼模型在心脏再生研究中的优势，特别着重于不同细胞类型在心脏微环境中的作用。通过对斑马鱼及其非凡的自然再生能力的研究，发现了其中许多作用。CM数目的恢复对心脏的再生和功能恢复至关重要，但是斑马鱼和其他再生模型的研究揭示了免疫细胞、心外膜细胞、神经、成纤维细胞和内皮细胞所传递的信号和其他功能对支持这种再生结果至关重要。未来的治疗方法需要保护或替代这些其他细胞类型以及CM才能有效。