真核表达人Wnt7b基因建立软骨细胞退变模型
发布人:管理员 浏览次数: 发布时间:2021-01-07
目的:在真核细胞中表达人Wnt7b基因,并观察其对原代大鼠软骨细胞的变性作用。
方法:24小时后,从SD大鼠的关节中除去软骨,用II型胶原酶消化多次,然后获得原代软骨细胞。收集P1细胞进行实验。将人Wnt7b基因扩增并克隆到PCDH-GFP中,并将PCDH-GFP和PCDH-Wnt7b转染到293ft细胞中。 48小时后收集细胞上清液和转染的细胞。 Western blot证实了Wnt7b在293ft细胞中的表达。将收集的上清液分别稀释10倍和50倍,培养大鼠软骨细胞,24小时后观察细胞形态,收集细胞蛋白和RNA。使用蛋白质印迹和定量PCR检测软骨变性指标MMP13、MMP3、II型胶原和A-。罐头,ADAMTS5、Col X和SOX9的表达。
结果:将人Wnt7b基因成功克隆到PCDH-GFP载体中,并在293英尺的细胞中有效表达。含Wnt7b的培养基插入软骨细胞24小时后,软骨细胞的形态从原来的多边形变为长纺锤形。 Wnt7b治疗组中MMP13和MMP3的表达明显上调,II型胶原的表达下调。 PCR结果显示A-can和Sox9表达降低,Col X和ADAMTS5表达增加。
结论:在真核细胞中有效表达Wnt7b基因,促进大鼠软骨细胞变性,并建立了软骨细胞变性的体外模型。
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