硫酸软骨素蛋白聚糖4（chondroitin sulfate proteoglycan 4，CSPG4）是硫酸软骨素蛋白聚糖家族中的一员，由核心蛋白和硫酸软骨素侧链组成，存在于人体正常组织中，对细胞的生长、黏附、迁移等有重要作用。CSPG4最先发现在黑色素瘤中高表达，也称作黑色素瘤蛋白多糖（melanomaproteoglycan，MPG）。大鼠体内存在CSPG4同源蛋白的神经元胶原抗原（neuron-glia antigen2，NG2），众多关于CSPG4结构和功能的报道是基于对啮齿类动物NG2的研究。CSPG4在正常组织中的表达受限，而在肿瘤组织尤其是在外周细胞活跃的肿瘤微环境中呈现高表达现象，同时也在不同胚胎起源的肿瘤特定祖细胞分化过程中表达，这一特性使CSPG4适合作为治疗肿瘤的靶点。CSPG4在肿瘤组织中的高表达会促进肿瘤细胞增殖、血管形成、耐药性、免疫逃逸和对放射治疗的抵抗等。本文就CSPG4的生物学特点及其在胶质瘤中的免疫抑制治疗研究进展进行综述。
1.CSPG4、NG2的基本结构
CSPG4是由15号染色体上的CSPG4基因编码的单次Ⅰ型跨膜蛋白，通常以1个约250kD的糖蛋白或450kD的蛋白多糖表达。其核心蛋白包括3个结构域：2225个氨基酸构成巨大的细胞外区，25个氨基酸组成的跨膜区和76个氨基酸组成的细胞内区。细胞外区又分D1、D2、D3，D1子域是靠近N端的球状结构域，由两个G型层黏连蛋白组成，靠二硫键维持其三级结构。D2子域由15个重复的CSPG二级结构组成，NG2中一些CSPG直接连接胶原蛋白Ⅴ和Ⅵ，有些CSPG是硫酸软骨素侧链（chondroitin sulfate，CS）修饰的潜在连接位点。
靠近细胞膜的D3子域是球状结构，其包含多个碳水化合物的修饰位点，可潜在结合半凝集素3和其他凝集素，还有整合素α3β1。D3子域还包含一些蛋白水解酶结合位点，能使其从细胞表面释放。跨膜区包含一个值得注意的半胱氨酸残基，可能和CSPG4在细胞表面的定位有关，但是还有待进一步实验验证。胞内区羧基末端的4个蛋白多糖残基构成一个连接在二级结构上的PDZ结构，这一结构可与线蛋白（MUPP1和GRIP1）的PDZ结构相结合。胞内区还含有几个潜在的苏氨酸磷酸化结合位点，可分别通过PCKa、ERK1、ERK2途径（NG2的磷酸化位点T2256/T2314和CSPG4的磷酸化位点T2252/T2310）进行磷酸化。
在羧基末端有一个富含脯氨酸的区域，可能进一步介导蛋白之间的相互作用，但是还有待验证。
2.CSPG4在胶质瘤免疫抑制治疗中的研究进展
2.1淋巴细胞介导的免疫抑制
在细胞毒性淋巴细胞中，NK细胞是最有效的抗肿瘤细胞，可在没有抗体依赖的情况下直接杀灭肿瘤细胞，现有研究表明：NK细胞能调节肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞表达，还能诱导辅助性T淋巴细胞（TH1）因子在肿瘤中的表达。通过细胞因子分泌，NK细胞的免疫调节能力可以使肿瘤相关巨噬细胞从“抗炎”向“促炎”倾斜，提高肿瘤的免疫编辑能力。胶质瘤超过70%的肿瘤相关细胞偏向于促进肿瘤细胞增殖的M2表型，而NK细胞的这些特性对胶质瘤免疫治疗的成功至关重要。利用NK细胞释放的细胞因子使免疫组织由“抗炎”向“促炎”转变的特性，把NK细胞和CSPG4/NG2的单克隆抗体mAb9.2.27二者结合来诱导抗体依赖的细胞毒性效应，以进一步探索NK细胞的治疗潜力。
被激活的NK细胞可以分泌与胶质瘤相关的干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF-α）。而IFN-γ能激活神经系统的小胶质细胞，小胶质细胞在神经系统中相当于巨噬细胞的作用，能杀灭胶质瘤细胞从而抑制肿瘤生长，在这一过程中mAb9.2.27对肿瘤杀伤效果没有显著影响。而TNF-α对胶质瘤的杀伤作用并不明确，因为胶质瘤能通过增强PI3K/AKT和NFκB信号传导来抵抗TNF-α对肿瘤细胞的杀伤。CSPG4/NG2可以作为肿瘤细胞相关抗原（tumor-associated antigens，TAA），特异性识别TAA的T细胞作为肿瘤靶点得到极大关注。随着单克隆抗体技术的发展，T细胞介导的淋巴系统产生特异性识别CD19的抗原受体嵌合体（chimeric antigen receptor，CAR），将会对恶性肿瘤的治疗产生重大影响，现已证明该疗法在黑色素瘤治疗方面的功效。因CSPG4在胶质瘤的广泛表达，将来也可应用于胶质瘤作为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CART）的治疗靶点。
携带CSPG4基因的嵌合抗原受体转导的T细胞能产生多种细胞因子，如TP41.2转导的T细胞和LN443系恶性胶质细胞共同培养，可以产生3种细胞因子：IFN-γ、TNF-α和粒细胞集落刺激因子（GM-CSF），这些细胞因子特异性杀伤表达CSPG4的肿瘤细胞。
2.2CSPG4/NG2抗体介导的免疫治疗
单克隆抗体Mab是针对专一的抗原决定簇产生的抗体，与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高、副作用小等优点。以CSPG4/NG2为靶点生产的单克隆抗体能特异性识别高表达CSPG4/NG2的肿瘤细胞。新生血管的形成是恶性肿瘤的主要特征，也是促使肿瘤生长和扩散的主要因素。周细胞是在肿瘤微环境中活跃表达的细胞，在胶质瘤新生血管中，CSPG4/NG2的单克隆抗体mAb2164H5与Ⅳ型胶原蛋白可并列嵌入到血管周围基底膜的周细胞，而mAb2161F9是针对肿瘤血管内壁周细胞的单克隆抗体。通过抗原抗体结合抑制周细胞活性，能有效抑制肿瘤血管形成，抑制肿瘤生长和转移，还有多种功能相似的单克隆抗体如mAb2161D7、mAb2166G4等，而2161D7/Glut-1、2166G4/Glut-1主要针对分散在肿瘤组织中的肿瘤细胞。CSPG4在细胞内的信号传递过程中起重要作用，能激活ERK和FAK等细胞内信号途径，而这些信号传导途径与肿瘤的生长和转移密切相关。
scFv-FcC21是一种特异性识别人类CSPG4的单链抗体，对胶质瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、白血病等恶性肿瘤均有特异性抑制作用，其对胶质瘤的抑制可能是通过干扰CSPG4在肿瘤信号传导中的作用，从而抑制肿瘤在体内及体外的增殖和转移。研究发现：ScFv-FcC21与CSPG4基因敲除的肿瘤细胞无明显反应，与CSPG4阳性表达的细胞可形成免疫沉淀，表明ScFv-FcC21对CSPG4阳性细胞的特异性抑制作用。
2.3基因治疗
基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正基因缺陷或异常引起的疾病，而胶质瘤正是由于CSPG4/NG2基因异常表达引起肿瘤细胞增殖、迁移。表达CSPG4的胶质瘤对放疗有更强的抵抗力，且能率先激活细胞有丝分裂的G1、G2位点应对DNA损伤。重组人过氧化物还原酶（PRDX-1）和CSPG4基因在胶质瘤细胞中表达均上调，用shRNA敲除U251中的PRDX-1，NG2的表达会明显受到影响，表达CSPG4的胶质瘤细胞有丝分裂的G2期会因PRDX-1的敲除而停止，U251的抗放疗能力会明显下降。
在体外和体内的研究中，CSPG4基因敲除的肿瘤细胞会减弱β-1整合素的信号传递功能，并增加肿瘤细胞对细胞毒性药物治疗的反应来增强化疗效果。在人类和动物的胶质瘤模型中，siRNA敲除CSPG4/NG2后能减缓肿瘤的生长速度，抑制肿瘤向周围组织的侵袭。β-1整合素的信号传递和后续的FAK磷酸化是促进肿瘤细胞增殖和迁移的一个关键机制，siRNA通过敲除周细胞的NG2基因能减少β-1整合素60%的活性，FAK磷酸化在NG2缺失的外周细胞中较对照组细胞也降低了40%。
siRNA通过暂时阻断NG2在胶质瘤中的表达，可增强胶质瘤细胞对凋亡因子如TNF-α的敏感性，持续抑制NG2基因在活体恶性胶质瘤细胞中的表达可减少肿瘤细胞的生长速度和体积。siRNA对NG2的基因沉默作用可以增加肿瘤细胞对TNF-α的敏感性，这样TNF-α就可以抑制肿瘤的生长。
3.CSPG4在胶质瘤免疫抑制治疗的前景
鉴于CSPG4在肿瘤组织中的分布和表达特点，CSPG4成为抗肿瘤治疗的合适靶点。随着CAR-T疗法最近几年的发展，该技术已经应用于临床。从人体分离出T细胞，经过基因改造增加T细胞特异性识别CSPG4抗原的功能，体外大量扩增后注入人体，消除免疫治疗过程中的不良反应，有针对性杀灭肿瘤细胞，使肿瘤的治疗从“延长寿命”向“彻底治愈”转变。随着单克隆抗体技术的发展，有目的的识别CSPG4抗原，通过抑制表达从而抑制肿瘤的发展，即使在缺少杀伤细胞的情况下也能起到抑制肿瘤的作用。未来还可以将针对CSPG4的单克隆抗体和化疗药物、生物毒素相结合制成“生物导弹”，定向杀灭肿瘤细胞，增强抗肿瘤效果，减少肿瘤药物的副作用，同时还可以通过抗体结合肿瘤细胞后激活体内肿瘤杀伤细胞进行治疗。CSPG4基因的表达在肿瘤及肿瘤干细胞的增殖、迁移过程中发挥重要作用，shRNA和siRNA抑制或敲除胶质瘤细胞的CSPG4基因的体外和体内实验都已取得成功。未来可以通过质粒或病毒作为载体把shRNA和siRNA导入人体肿瘤细胞，抑制CSPG4基因的表达，控制肿瘤的进展。根据CSPG4的蛋白结构，胞外区靠近胞膜的D3子域有多个碳水化合物修饰位点和蛋白水解酶的结合位点，能否通过破坏CSPG4的蛋白结构来抑制其表达还有待进一步研究。
来源：中国微侵袭神经外科杂志2017年1月第22卷第1期
