第一次CRISPR-Cas9基因编辑技术被用于整体生物模型中系统地靶向基因组中的每一个基因。来自Broad研究所和麻省理工学院David H. Koch综合癌症研究所的一个科学家小组，率先利用这一技术在一个癌症动物模型中系统地“敲除”(关闭)了整个基因组的所有基因，揭示出了与肿瘤进化和转移相关的一些基因，这为在其他细胞类型和疾病中从事类似的研究铺平了道路。这项研究工作在线发表在3月5日的《细胞》(Cell)杂志上。

  共同资深作者、哈佛-麻省理工Broad研究所核心成员、麻省理工McGovern脑研究所研究员、麻省理工学院大脑、认知科学与生物工程学系助理教授张锋(Feng Zhang)说：“全基因组向导RNA(guide RNA, gRNA)库是一个强大的筛查系统，我们带着激动的心情开始将它应用于动物模型中来研究基因功能。这项研究是朝着利用Cas9在体内鉴别癌症和其他复杂疾病中的重要基因迈出的第一步。”

  共同资深作者、麻省理工学院教授、Broad研究所董事会成员及Koch研究所成员Phillip Sharp说：“肿瘤进化是一系列受到基因网络调控的、极为复杂的过程。在体内应用基因编辑是功能基因组研究的一个强大平台，它为探究肿瘤进化中的每一步以及鉴别出调控这些过程的基因提供了一种新方法。”

  借助于CRISPR-Cas9基因编辑技术，科学家们能够调查一些基因和遗传突变在人类生物学及疾病中的作用。这一系统可以在DNA水平上消除基因的功能，相比之下像RNA干扰一类的遗传干扰技术则是在RNA水平上发挥作用。以往Broad研究所的科学家们曾利用CRISPR-Cas9技术在一些细胞模型中完成了全基因筛查，但这种方法并没有捕捉到在整体生物体内起作用的复杂过程。例如，为了实现癌症转移，恶性细胞必须离开原发肿瘤，进入血管迁移到机体的远端部位。张锋与Sharp协作通过在一个整体动物模型中应用CRISPR-Cas9技术，搜索了参与转移的基因。

  在新研究中，研究人员利用Broad研究所的“小鼠全基因组CRISPR敲除文库A” (mGeCKOa)(靶向小鼠基因组中所有基因的CRISPR向导RNA汇合文库)，以及Cas9 DNA切割酶处理了来自非小细胞肺癌(NSCLC)小鼠模型的细胞。这一系统将突变导入到了一些特定基因中，破坏了它们的序列并阻止了这些基因生成蛋白。这一方法确保了在每个细胞中只有一个基因被敲除，在培养的异质细胞群中则以小鼠基因组中的所有基因作为靶标。研究人员随后将这些细胞移植到小鼠体内，发现用这一基因敲除文库处理的一些细胞形成了高转移性肿瘤。

  利用新一代测序，科学家们鉴别出了在原发肿瘤及转移灶中敲除的基因，指出了一些基因有可能是通常抑制肿瘤生长的肿瘤抑制基因，当敲除它们时会促进肿瘤生长。

  研究结果突出显示了一些在人类肿瘤中众所周知的肿瘤抑制基因，包括Pten、Cdkn2a和Nf2，也涵盖了一些从前未与癌症关联的基因。出乎意料地是，这一筛查系统还揭示了几个microRNAs。

  仍然还需要开展更多的实验工作来全面探究筛查中发现的一些基因和microRNAs。一些转移肿瘤在临床很少进行活组织检查导致研究样本稀缺，而未来将转移灶纳入到癌症测序研究将更加深入地了解这一研究中的一些基因突变。

  研究人员可利用这一Cell论文中相同的体内筛查方法来检测基因过表达的效应，筛查循环肿瘤细胞或其他细胞系，探讨其他的癌症表型，例如癌症干细胞、宿主-环境互作和血管发生。

  共同第一作者、Sharp实验室博士后研究人员Sidi Chen说：“我们的研究工作提供了一种原理证明体内敲除筛查方法，它可用于鉴别调控肿瘤进化不同路线及步骤的基因。”

  这项研究还采用一种高效多层次的筛查策略：利用一个较小的、更为集中的向导RNAs池来验证顶端基因突变。“在完成无偏倚的全基因组筛查后，我们设计出了一个子库来快速地检测更多的靶标，而非在个体小鼠中靶向单个基因。这一子库让我们看到了在相同肿瘤中这些不同的遗传突变是如何竞争的。”

  原文链接：Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and metastasis

Genetic screens are powerful tools for identifying genes responsible for diverse phenotypes. Here we describe a genome-wide CRISPR/Cas9-mediated loss-of-function screen in tumor growth and metastasis. We mutagenized a non-metastatic mouse cancer cell line using a genome-scale library with 67,405 single-guide RNAs (sgRNAs). The mutant cell pool rapidly generates metastases when transplanted into immunocompromised mice. Enriched sgRNAs in lung metastases and late-stage primary tumors were found to target a small set of genes, suggesting that specific loss-of-function mutations drive tumor growth and metastasis. Individual sgRNAs and a small pool of 624 sgRNAs targeting the top-scoring genes from the primary screen dramatically accelerate metastasis. In all of these experiments, the effect of mutations on primary tumor growth positively correlates with the development of metastases. Our study demonstrates Cas9-based screening as a robust method to systematically assay gene phenotypes in cancer evolution in vivo.