生物学研究离不开定量。对于绝对定量，通常需要利用已知浓度的分子绘制标准曲线。最近，麻省理工学院、梅约诊所和赛默飞世尔科技的研究人员在《Nature Communications》杂志上介绍了一种新方法，能利用串联质谱仪对多个蛋白质进行绝对定量。
这种方法称为MARQUIS(Multiplex Absolute Regressed Quantification with Internal Standards)，依靠两种现成的技术：重同位素标记的合成肽段以及质谱的同位素标记试剂。iTRAQ和TMT等试剂有着相同的分子量，但在质谱仪内产生特征的片段。
在MARQUIS方法中，对于每个待定量的肽段，研究人员建立重同位素标记的肽段。他们以不同的量混合这些肽段，并在组织或细胞裂解后立即将一种混合物加入每个生物样品中。研究小组的负责人Forest White认为：“这是关键的一步。你要尽早加入这些肽段，这样重同位素标记肽段和内源肽段的损失可同时发生。”
随后以同位素试剂标记样品，并加入质谱仪中。每个肽段产生两个峰：“重”峰代表合成的(加标)肽段，而“轻”峰代表内源性蛋白。通过定量前者碎片化所产生的标记离子，研究人员能产生每个肽段的标准曲线。之后他们能测定对应内源性肽段的信号，确定样品中存在多少分子。
研究小组利用MARQUIS定量了EGFR信号通路中的酪氨酸磷酸化。在几种配体刺激之后，他们在多个时间点定量了EGFR网络内的磷酸化动力学，实现了EGFR磷酸化位点的定量比较，并证明了对于每种配体，受体磷酸化在性质上相似，但数量上不同。他们还培养了胶质母细胞瘤异种移植物，并应用这种方法定量了EGFR激酶抑制的效果。
“有了这种方法，你就能看到那儿有多少靶点，药物是否命中靶点，以及更重要的是，靶点抑制是否有效阻断了下游的磷酸化，”White说。
据介绍，MARQUIS能同时定量10个样品中多达100种肽段。这只需要一台串联质谱仪(如三重四级杆)、市售的同位素标记试剂，以及重同位素标记的合成肽段。White 认为：“每个人都能实现。我们希望创建出一种相当简单的方法，而不需要什么诀窍。”
原文链接：MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications
Absolute quantification of protein expression and posttranslational modifications by mass spectrometry has been challenging due to a variety of factors, including the potentially large dynamic range of phosphorylation response. To address these issues, we have developed MARQUIS—Multiplex Absolute Regressed Quantification with Internal Standards—a novel mass spectrometry-based approach using a combination of isobaric tags and heavy-labelled standard peptides, to construct internal standard curves for peptides derived from key nodes in signal transduction networks. We applied MARQUIS to quantify phosphorylation dynamics within the EGFRnetwork at multiple time points following stimulation with several ligands, enabling a quantitative comparison of EGFR phosphorylation sites and demonstrating that receptor phosphorylation is qualitatively similar but quantitatively distinct for each EGFR ligand tested. MARQUIS was also applied to quantify the effect of EGFR kinase inhibition on glioblastoma patient-derived xenografts. MARQUIS is a versatile method, broadly applicable and extendable to multiple mass spectrometric platforms.
