蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

原理如下图：

       但是该技术却非常依赖经验的积累，为了给广大实验同仁们提供有意义的参考和经验，小编将提供解决实验过程中遇到问题的一些办法，仅供参考。

 电泳转印不成功？

1、转印时间过短

2、电源条件不适当

       转印开始前核实电流；更换缓冲液或增加电压设定值；尝试高电场强度转印；核实电源最高的电流值。

3、蛋白转印穿透印迹膜

       如果印迹膜功率条件设定太高或转印时间过长，蛋白会穿过膜并转印到滤纸上。

4、蛋白转印方向相反

       凝胶/印迹膜三明治结构组装顺序相反或放入相反的电极板间；核实电源线的电极是否接反。

5、检测系统失灵或灵敏度太低

       加入适当的阴、阳性抗原对照试剂以检测试剂盒的灵敏度。

6、错误的电荷质量比

       使用更酸或更碱性的缓冲液增加转印效率；蛋白在它们的等电点附近不能全部转印（缓冲液的PH值应该比靶蛋白的等电点低或高2个PH值）

7、蛋白在凝胶中沉淀

       在缓冲液加入少量的SDS；消除或降低转印缓冲液中乙醇的含量

8、缓冲液中的甲醇抑制蛋白洗脱

       降低甲醇的含量，通常使用量为20%

9、电源线路故障或电源使用不当

       检查保险丝，检查电源输出功率

10、凝胶浓度过高

       降低%T(全单体)或%C(交联体)。使用5%C（甲叉丙烯酰胺交联剂），可使凝胶孔径最小。降低凝胶孔径最小。降低凝胶浓度，增大孔径，可以提高转印效率

蛋白印记免疫检测出现高背景

1、封闭不完全

2、清洗不充分

       增加清洗次数、时间以及清洗剂的去污力。

       在抗体缓冲液中加入Tween-20会降低非特异结合。

3、印迹膜在底物溶液中放置时间过长

4、电泳或转印过程中污染

5、凝胶上的蛋白样品过载或在转印缓冲液中使用了过多的SDS，蛋白直接穿透印迹膜并在转印体系中循环而不能结合在印迹膜上

6、一级或二级抗体浓度过高

7、温育槽被污染

清洗温育槽或使用一次性温育槽

中洪WB实验流程：

       ①做胶：先制成分离胶和压缩胶。

       ②上样：先做好制胶器平板，先后加入已制成的分离胶和压缩胶（需要大概十几分钟反应十几，与温度相关，成反比），之后加梳子（有孔，方便后期加入蛋白）加入蛋白。

       ③跑电泳：需要三个小时。

       ④转膜：把PVDF膜贴在胶上。

       ⑤封闭：封闭不需要的蛋白。

       ⑥一抗孵育：用的抗体是特定的，放在摇床上，时间需要一上午。

       ⑦洗膜：把多余的抗体洗掉，洗三次，每次十分钟。

       ⑧二抗孵育：抗体是通用的，只要来源相同即可。

       ⑨再次洗膜：把多余的抗体洗掉，洗三次，每次十分钟。

       ⑩曝光：放在成像仪上面成像。（条带清晰，直，无气泡，结果就是好的）

中洪WB实验操作与结果案例图