DNA原位核酸杂交方法2
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-09-27
二、生物素标记DNA探针在石蜡切片上的检测方法。
（1）固定：组织以10%中性福尔马林液，常规石蜡包埋，切片厚4-6 μm，最好用硅化玻，60℃烤片6-8 h。
（2）脱蜡至酒精，空气中干燥。
（3）蛋白酶K（1 μg/ml 溶于0.1 mol/L PBS中），37℃20-25 min。
（4）PBS漂洗5 min×2。
（5）脱水，从低浓度到高浓度至无水乙醇，空气中干燥。
杂交反应
（1）变性和杂交
加杂交液20μl/每张切片，加盖硅化盖片，将切片置于95℃10 min，使探针变性，DNA双链解成单链，然后迅速置于冰上1min，再将切片置于盛有2×SSC湿盒内，37-42℃过夜（16-18 h）。有条件也可用原位杂交仪进行变性和杂交。
（2）杂交后漂洗
①将杂交玻片从湿盒（或杂交仪）中取出，用2×SSC将盖玻片洗脱
②用2×SSC30℃洗2次，每次5 min
③用1×SSC42℃洗2次，每次5 min
④TBS缓冲液洗2次。
注意在漂洗过程中切片不能干燥。
（3）杂交信号的检测
与免疫组化方法类似，现在大多数的研究都是采用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶与抗半抗原抗体（或抗生物素蛋白）连接进行检测。
①在切片组织上滴加碱性磷酸酶标记的链菌素溶液，室温孵育20-40 min
②TBS缓冲液洗3次×5 min
③滴加BCIP/NBT，室温暗处显色10-30 min，TBS缓冲液洗
④0.1%核固红复染1 min，蒸馏水冲洗
⑤酒精脱水，中性树胶封片。
（4）杂交结果
（1）固定：组织以10%中性福尔马林液，常规石蜡包埋，切片厚4-6 μm，最好用硅化玻，60℃烤片6-8 h。
（2）脱蜡至酒精，空气中干燥。
（3）蛋白酶K（1 μg/ml 溶于0.1 mol/L PBS中），37℃20-25 min。
（4）PBS漂洗5 min×2。
（5）脱水，从低浓度到高浓度至无水乙醇，空气中干燥。
杂交反应
（1）变性和杂交
加杂交液20μl/每张切片，加盖硅化盖片，将切片置于95℃10 min，使探针变性，DNA双链解成单链，然后迅速置于冰上1min，再将切片置于盛有2×SSC湿盒内，37-42℃过夜（16-18 h）。有条件也可用原位杂交仪进行变性和杂交。
（2）杂交后漂洗
①将杂交玻片从湿盒（或杂交仪）中取出，用2×SSC将盖玻片洗脱
②用2×SSC30℃洗2次，每次5 min
③用1×SSC42℃洗2次，每次5 min
④TBS缓冲液洗2次。
注意在漂洗过程中切片不能干燥。
（3）杂交信号的检测
与免疫组化方法类似，现在大多数的研究都是采用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶与抗半抗原抗体（或抗生物素蛋白）连接进行检测。
①在切片组织上滴加碱性磷酸酶标记的链菌素溶液，室温孵育20-40 min
②TBS缓冲液洗3次×5 min
③滴加BCIP/NBT，室温暗处显色10-30 min，TBS缓冲液洗
④0.1%核固红复染1 min，蒸馏水冲洗
⑤酒精脱水，中性树胶封片。
（4）杂交结果
DNA原位核酸分子杂交阳性反应为靶基因存在的部位，一般在细胞核内，呈紫蓝色颗粒状，阴性细胞核呈红色。(转帖)
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