RFLP实验操作步骤
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-03-09
一、材料
基因组DNA（大于50 kb，分别来自不同的材料）。
二、设备
电泳仪及电泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板（比胶块略大）4块，吸水纸若干，尼龙膜（依胶大小而定），滤纸，eppendorf管（0.5 ml）若干。
三、试剂：
1. 限制性内切酶（BamHⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ，XbaⅠ）及10×酶切缓冲液。
2. 5×TBE电泳缓冲液。
3. 变性液：0.5 mol/L NaOH，1.5 mol/L NaCl。
4. 中和液：1 mol/L Tris·Cl，pH7.5/1.5 mol/L NaCl。
5. 10×SSC。
6. 其它试剂：0.4 mol/L NaOH，0.2 mol/L Tris·Cl，pH7.5/2×SSC，ddH2O，Agarose0.8%，0.25 mol/L HCl。
四、操作步骤
1. 基因组DNA的酶解
（1）大片断DNA的提取详见基因组DNA提取实验，要求提取的DNA分子量大于50 kb，没有降解。
（2）在50 μl 反应体系中，进行酶切反应：
5 μg 基因组DNA
5 μl 10×酶切缓冲液
20单位（U）限制酶（任意一种）
加ddH2O，至50 μl
（3）轻微振荡，离心，37℃反应过夜。
（4）取5 μl 反应液，0.8%琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30 kb 的明显亮带出现。
2. Southern转移
（1）酶解的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳（可18 V 过夜）后EB染色观察。
（2）将凝胶块浸没于0.25 mol/L HCl中脱嘌呤，10分钟。
（3）取出胶块，蒸馏水漂洗，转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。
（4）预先将尼龙膜，滤纸浸入水中，再浸入10×SSC中，将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸（桥）然后将胶块反转放置，盖上尼龙膜，上覆二层滤纸，再加盖吸水纸，压上半公斤重物，以10×SSC盐溶液吸印，维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。
（5）取下尼龙膜，0.4 mol/L NaOH30秒，迅速转至0.2mol/LTris·Cl，pH7.5/2×SSC，溶液中，5分钟。
（6）将膜夹于2层滤纸内，80℃真空干燥2小时。
基因组DNA（大于50 kb，分别来自不同的材料）。
二、设备
电泳仪及电泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板（比胶块略大）4块，吸水纸若干，尼龙膜（依胶大小而定），滤纸，eppendorf管（0.5 ml）若干。
三、试剂：
1. 限制性内切酶（BamHⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ，XbaⅠ）及10×酶切缓冲液。
2. 5×TBE电泳缓冲液。
3. 变性液：0.5 mol/L NaOH，1.5 mol/L NaCl。
4. 中和液：1 mol/L Tris·Cl，pH7.5/1.5 mol/L NaCl。
5. 10×SSC。
6. 其它试剂：0.4 mol/L NaOH，0.2 mol/L Tris·Cl，pH7.5/2×SSC，ddH2O，Agarose0.8%，0.25 mol/L HCl。
四、操作步骤
1. 基因组DNA的酶解
（1）大片断DNA的提取详见基因组DNA提取实验，要求提取的DNA分子量大于50 kb，没有降解。
（2）在50 μl 反应体系中，进行酶切反应：
5 μg 基因组DNA
5 μl 10×酶切缓冲液
20单位（U）限制酶（任意一种）
加ddH2O，至50 μl
（3）轻微振荡，离心，37℃反应过夜。
（4）取5 μl 反应液，0.8%琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30 kb 的明显亮带出现。
2. Southern转移
（1）酶解的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳（可18 V 过夜）后EB染色观察。
（2）将凝胶块浸没于0.25 mol/L HCl中脱嘌呤，10分钟。
（3）取出胶块，蒸馏水漂洗，转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。
（4）预先将尼龙膜，滤纸浸入水中，再浸入10×SSC中，将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸（桥）然后将胶块反转放置，盖上尼龙膜，上覆二层滤纸，再加盖吸水纸，压上半公斤重物，以10×SSC盐溶液吸印，维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。
（5）取下尼龙膜，0.4 mol/L NaOH30秒，迅速转至0.2mol/LTris·Cl，pH7.5/2×SSC，溶液中，5分钟。
（6）将膜夹于2层滤纸内，80℃真空干燥2小时。
（7）探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。
此文转载来源：丁香通
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