材料、设备及试剂

一、材料

不同来源的模板DNA。

二、设备

移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，台式高速离心机。

三、试剂：

1、10×PCR反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris?Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％ Triton X-100。

2、MgCl2 ：25mmol/L。

3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。

4、Taq DNA聚合酶5U/μl。

操作步骤

一、PCR反应

1. 依次混匀下列试剂
35μl H2 O
5μl 10×PCR反应缓冲液
4μl 25mmol/L MgCl2
4μl 4种dNTP
0.5μl 上游引物（引物１）
0.5μl 下游引物（引物２）
0.5μl 模板DNA(约1ng)
   混匀后离心5秒。

2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶（0.5μl约2.5U），混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。

3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。

二、电泳
取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。

[注意]
1.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。

      2.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。

   3.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。

此文转载来源：丁香通