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PCR-SSCP 技术实验

实验原理

 

聚合酶链式反应-单链构象多态(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation PolymorphismPCR-SSCP)技术是在PCR技术基础上发展起来的,它是一种简单、快速、经济的用来显示在PCR反应产物中单碱基突变(点突变)的手段。该方法已被用做癌基因和抑癌基因突变的筛查检测,遗传病的致病基因分析和基因诊断,基因制图等领域。

 

SSCP测定中,双链DNAdsDNA)被变性成为单链DNAssDNA),每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象,即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下,用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,单链DNA的迁移率和带型,都取决于其折叠构象和电泳时的温度。

 

试剂与材料

 

1.样本DNA100 ng/ml)、MTHFR上下游引物(5 pmol/ml)、Taq DNA聚合酶(5 U/ml)、10×PCR反应缓冲液、4×dNTPs2.5 mmol/L)、30%丙烯酰胺(交联度49:1)、5×TBE缓冲液、10%过硫酸铵(现用现配)、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液。

 

2.微量加样器、PCR自动热循环仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。

 

实验步骤

 

一、PCR反应

 

20 ml反应体系成分如下:

 

模板DNA100 ng/ml)        1 ml

 

10×PCR反应缓冲液           2 ml

 

Taq DNA聚合酶(5 U/ml)   0.2 ml

 

4×dNTPs2.5 mmol/L)      1 ml

 

MTHFR上下游引物          各 1 ml

 

ddH2O 加至终体积           20 ml

 

PCR反应循环参数:

 

955 min

 

9430 s6250 s7290 s,共30个循环;

 

727 min

 

反应结束后,置4℃保存。

 

二、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

 

1.制备6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶:30%聚丙烯酰胺(交联度49:110 ml5×TBE缓冲液10 ml,加蒸馏水至50 ml,加TEMED 25 ml10%过硫酸铵250 ml,混匀后灌胶,插入加样梳子。待胶完全聚合后,拔出加样梳子,安装电泳装置,加入电泳缓冲液(1×TBE),缓冲液应高于加样孔上缘,用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。

 

2.取5 ml 扩增产物加10 ml变性上样缓冲液混匀,98℃变性10 min,迅速冰浴。

 

3.取5 ml混合液加到点样孔中,以18 V/cm电泳45 h

 

三、聚丙烯酰胺凝胶染色

 

1.拆下电泳装置,取出聚丙烯酰胺凝胶,放到一个塑料盘内,用蒸馏水冲洗12遍。

 

2.倒入固定液,固定810 min

 

3.用蒸馏水冲洗12遍;倒入银染液,银染1012 min

 

4.用蒸馏水冲洗若干遍;倒入显色液,显色至出现清晰的银染带。

 

5.用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶,观察PCR-SSCP结果。

 

结果判断

 

观察并记录聚丙烯酰胺凝胶上的DNA单链带,根据异常泳动变位筛查突变样本。

 

应用

 

在遗传学方面的有广泛的应用,例如,癌基因或抑癌基因的基因突变的筛查,遗传病的致病基因的突变筛查和基因诊断等。

 

注意事项

 

1.靶DNA序列长度不宜过长,否则灵敏度下降。

 

2DNA样品在电场中泳动的长度一般要求在1618 cm以上。

 

3.染色最好在塑料盘中进行。




此文转载来源:丁香通

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