试剂、试剂盒         

dNTP 溶液 MgCl2 溶液PCR 缓冲液引物尿嘧啶-DNA-糖基酶 Taq DNA 聚合酶

仪器、耗材     

PCR 仪离心管

实验步骤   

     

一、材料

 

1. 试剂

 

（1）dNTP溶液（含有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，每种浓度10 mmol/L)多数情况下，直接替换dUTP就可以了（RySandPersingl993;Koxetal.1994)。如果必要的话，为了补偿对聚合酶的抑制作用，dUTP终浓度可提高到 0.6~1 mmol/L(Wangetal.1992;Hohlfeldetal.1994)。

 

（2）MgCl2溶液，50 mmol/L

 

多数情况下Mg2+终浓度达到1.5 mmol/L就足够了，然而应根据核苷酸（如dUTP)浓度和引物特异性适当优化。提高核苷酸浓度同时应提高Mg2+浓度。

 

（3）PCR缓冲液，10X(100 mmol/LTris-HCl , pH8.4,500 mmol/L KCl ）

 

2. 引物

 

正向引物（l0umol/L)

 

反向引物（l0umol/L)

 

3. 酶

 （1）尿嘧啶-DNA-糖基酶，1U/ul（Invitrogen)

1UUDG 可以去除 5ng 污染物，根据要求的净化程度可以减少到0.01 活性 U(KoxetaL1994)B（2）Taq DNA 聚合酶 5U/ul

 

热启动 Platinum7'叫 DNA 聚合酶 Invitrogen10966-018) 允许在室溫条件下准备 PCR 反应液。

 

4. 设备

 

可以设定程序（注意在「二、方法」中的（3）和（4）有修改）的 PCR 仪、PCR 扩增用薄壁离心管。

 

二、方法

 

（1）在灭菌的离心管中于冰上加入下列试剂。

 

10 x PCR 缓冲液                  5ul

 

dNTP 溶液                            1 ul

注：dNTP 溶液，含有 dATP、dCTP、dGTP 和 dUTP, 每种浓度 10 mmol/L

 

正向引物、反向引物             1 ul（每种 l0umol/L）尿嘧啶-DNA-糖苷酶 1U/ul       1U

 

TagDNA 聚合酶（5U/ul）      0.5ul

 

MgCl2(50 mmol/L)                 1.5ul

 

H20                                         40ul

 

（2）37°C 温育 l0min。

这一步 UDG 可以从污染物中去除屎嘧啶残基。据报道这一净化过程也可以在室溫条件下完成（dcWitetal.1993；Wangetal.1992).

 

（3）94°C 加热 l0min, 失活 UDG 并水解污染的 DNA(Hohlfeldetal.1994;Koxetal.1994)。

 

（4）在标准 PCR 基础上增加 2 个循环。

 

增加 2 个循环可以补偿 dUTP 对扩增效率的影响（Longoetal.1990)。

 

（5）在 PCR 结束之前，将温度保持在 72°C, 直至储存。

 

据报道，PCR 结束后如果降低温度，大肠埃希菌 UDG 会恢复一小部分催化活性。

 

（6）把含尿嘧啶 DNA 以及含有 UDG 活性的反应混合物 -20°C保存。

此文转载来源：丁香通