蛋白印迹法

五 抗原-抗体反应

1 仪器和设备

塑料盒、振荡器。

2 封闭

一般采用5%脱脂奶粉进行封闭，室温，30-60min。

*封闭液的浓度可以是（1%-5%），根据自己的条件摸索浓度就可以。

封闭液的配置除了PBS-T液之外也可以使用TBS-T液或10mmol/L Tris-HCL(PH 7.4)溶液。

3 一抗的处理

（1）一抗稀释倍数：根据样本和抗体的种类不同，预实验寻找选择最适稀释倍数。

（2）一抗孵育时间：一抗的孵育时间是从几个小时到过夜不等，建议使用较高较高的稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。一抗过高会产生非特异性条带。

（3）一抗孵育时间：尽可能低温孵育，特别是磷酸化一抗过夜时应在4℃进行，否则会产生污染而破坏磷酸化蛋白。

*孵育一抗最好在摇床上进行，防止结合不均匀。