一、E.coli/phage 裂解液预吸附血清

 

1. 将E.coli /phage lysate 以1:10-20 稀释在TBST 溶液中。

 

2. 将4 张82mm 的nitrocellulose membranes（NC）浸入稀释后的E.coli/ phagelysate 中，室温下水平摇动30 分钟，取出NC 并使膜沥干。

 

3. 用50ml TBST 溶液洗膜3 次，每次10 分钟。

 

4. 用滤纸轻轻吸去膜上的液体。

 

5. 将膜放入50ml 封闭液中，室温下水平摇动最少30 分钟。

 

6. 将膜从封闭液中取出，用50ml TBST 溶液洗膜3 次，每次10 分钟。

 

7. 将血清按1:5 稀释在TBST 溶液中，将一张膜放入溶液中，37℃下轻轻水平摇动10 分钟。

 

8. 从血清稀释液中取出膜并丢弃,加入另外一张新膜,37℃下轻水平摇10 分钟.

 

9. 重复步骤8，直至所有4 张膜都处理完。

 

10. 除去最后一张膜，收集血清（prima ry antibody），分装成小份储存于-80℃冰箱中待用。

 

注意：

该步处理过程是为了去除血清中能与细菌和噬菌体裂解蛋白进行免疫反

应的抗体，这样可以减少假阳性率；

一抗不能反复冻融，化冻后不要再次冰冻，可放于4℃作短暂保存；

可以是病人血清，也可以是免疫血清，如果是病人血清，则需要至少10个病人血清进行混合；

二、噬菌体筛选

 

1. 准备NZY agar plates（至少用前24 小时倒好），用前在37℃培养箱中烘烤1-2 小时以去除水滴。

 

2. 将过夜培养的XL1-blue MRF’细菌2000 转/分，离心10 分钟，将细菌溶解在10mM MgSO4 中，调整细菌浓度为OD600=0.5。

 

3. 融化NZY top，并将NZY top 放在50℃水浴中。

 

4. 将适量的XL1-blue MRF’细菌溶液与一定稀释度的phage 文库混合，37℃下共同作用15 分钟。

 

直径90mm 平板：200μl XL1-blue 细菌+适量的phage 文库

 

直径150mm 平板：600μl XL1-blue 细菌+适量的phag 文库（噬菌斑数量一般保持在3000pfu/90mm; 12000pfu/150mm）

 

5. 将步骤4 中的混合液与NZY top 溶液混合（200μ l 混合液+3-4mlNZY top 溶液；600μ l 混合液+8-10 ml NZY top 溶液），倒入到NZY agar plates 中，室温下放10 分钟左右，然后倒置放于37℃下培养。

 

6. 当噬菌斑刚好可看到时（大约5-8 小时），从培养箱中拿出平板。

 

7. 将NC 放入10mM IPTG 溶液中完全浸湿，在空中使膜沥干，并做好3 个不对称的标记。

 

8. 将IPTG 处理好的NC 贴在平板上，不留气泡，然后倒置放于37℃下培养。

 

9. 过夜培养后，第二天早上取出平板，用镊子将膜轻轻掀起，注意不要将培养基粘在膜上。

 

10. 将膜放于50ml TBST 溶液中，水平脱色摇床上震荡洗膜3 次，每次10 分钟。

 

11. 将膜放入50ml 封闭液中，水平摇动，封闭4-6 小时。

 

12. 在封闭液中加入适当滴度的一抗，水平摇动处理过夜。

13. 将膜放于50ml TBST 溶液中，洗膜3 次，每次10 分钟。

 

14. 在封闭液中加入适当滴度的二抗（各个公司的二抗使用滴度不同），室温水平摇动1-2 小时。

 

15. 将膜放于50ml TBST 溶液中，洗膜3 次，每次10 分钟，最后用50ml TBS溶液洗膜15-20 分钟，取出膜空气中沥干。

 

16. 将膜放入BCIP-NBT 显色液中避光显色，水平摇动直到阳性斑点可见为止。

 

17. 从显色液中取出膜放在TBS 溶液中，空气中使膜干燥。

 

18. 根据所做的标记,将膜与平板对齐,将平板上对应的阳性克隆区域的培养基挖出放入500μl SM buffer 中,并加入25 ml chloroform,4℃贮存（最多可贮6 月）。

19. 第一轮筛选得到阳性克隆需要进行第二轮筛选以去除假阳性并获得阳性单克隆噬菌体。过程如第一轮筛选，只不过用直径90mm 平板；具体过程见步骤4，这时所加入的噬菌体溶液是第一轮筛选得到的噬菌体上清（见步骤18），在用前要滴定好噬菌体的滴度，噬菌斑的数量以可区分出单个克隆，同时密度不能太稀为标准（一般100-200 pfu/90mm）。

 

20. 按第一轮相似的过程进行实验，最后显色，确定真正的阳性克隆，并将阳性单克隆所在的培养基挖出放入500μl SM buffer 中，并加入25 ml chloroform，4℃贮存（最多可贮存6 月）。

 

注意：

封闭液一般可用：5%的脱脂牛奶或1%的BSA 溶解在TBST 溶液中。

第一轮筛选用150mm 的平板；第二轮筛选用90mm 的平板，一般需要筛选至少1 x 106 pfu。

认真做好三个不对称的标记，特别在第二轮挑选阳性克隆时要仔细将膜与平板吻合好，不能挑错。

 

三、单克隆剪切

 

1. 取第二轮筛选得到的阳性克隆贮存液上清。

 

2. 将过夜培养的XL1-blue MRF’细菌2000 转/分离心10 分钟，将细菌溶解在10mM MgSO4 中，调整细菌溶度到OD600=1.0。

 

3. 在一个EP 管中加入：200μl XL1-blue MRF’细菌+250ul phage stock（步骤1）+1 ul ExAssist helper phage。

 

4. 将以上三种样品混合，37℃下共同保温15 分钟。

 

5. 将样品混合物加入到3 ml LB 培养基中，37℃震荡培养3-4 小时。

 

6. 将试管放于65-70℃水浴20 分钟，3000 转/分，离心15 分钟。

 

7. 将上清转入新的离心管中，已发生剪切的phage particles 在上清中（上清可在4℃下储存1-2 月）。

 

8. 将100ul phage 上清+200ul SOLR cells（OD600=1.0）混合，37℃保温15 分钟。

9. 取步骤8 中溶液5-10 ul 涂于LB-amp agar plates（amp=50ug/ml），过夜培养。

 

10. 第二天细菌长出，随机挑取单克隆接种到LB-amp 培养基中培养过夜。

 

11. 过夜培养细菌分为三部分：（1）提取质粒做双酶切，鉴定外源基因的大小；（2）送样品进行DNA 测序（3）加入30-40%的甘油进行保种，分装成小份储存于-80℃备用。

 

附录：

1、SM buffer(1L)：(5.8 g NaCl+2.0 g ma gnesium sulfate+50 ml 1M Tris (pH=7,5)+0.1 g gelatin)

2、AP-buffer：(100 mM Tris HCI (pH 9.5) ; 100 mM NaCl ; 5 mM MgCl2)

3、10xTBS(1L)：(0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)；1.5 M NaCl)

4、LB Broth(1L)：(10 g NaCl+10 g of tryptone +5 g of yeast extract)

此文转载：丁香通