试剂、试剂盒        

NaOH.寡聚脱氧胸苷 (oligo(dT) ] 纤维素DEPC 处理的水1X 加样缓冲液洗脱缓冲液 NaAc(pH5.2)乙醇 TE 缓冲液。

实验步骤      

一 材料与设备

1 ) 5 mol/L NaOH

2 ) 寡聚脱氧胸苷 (oligo(dT) ] 纤维素

3) DEPC 处理的水

4) 1X 加样缓冲液：20 mmol/L Tris-CL PH (6.7). 0.5 mol/L NaCl, l mmol/L EDTA( pH 8. 0 ). 0.1% 十二烷基肌氨酸钠

5 ) 洗脱缓冲液 ： lO mmol/L Tris-Cl ( PH7. 6 ) ， l mmol/L EDTA( PH 8.0) ， 0.05% SDS

6) 3 mol/ L NaAc (pH5.2)

7 ) 乙醇

8) TE 缓冲液

二 操作方法

1) 先用 l0 ml5mol/LNaOH 清洗硅化的层析柱，然后用水冲洗。取 0.5 g oligo（df) 纤维素干粉加于 1m]0.1mol/LNaOH 中，倒人柱内，以约 l0 ml 的水冲洗。(层析柱可用硅化的巴斯德吸管堵上已硅化的玻璃棉制成或用容量为 2 ml 的已硅化的一次性柱子

2) 用 10〜20℃ 加样缓冲液平衡柱子，至流出液 pH 约 7.5

3) 于 70°C 加热含 2 mg 总 RNA 的水溶液 lOmin，迅速冷却至室温，加等体积的 2X 加样缓冲液，上样，立即用无菌试管收集流出液。并以一倍柱体积的加样缓冲液洗涤，将流出液于 70℃ 温育 5 min，重新上柱 2 次。

4) 用 5〜10 倍柱体积的加样缓冲液洗柱，分步收集洗出液，每份 1 ml，测定每一收集管的 OD260。洗脱至 OD260 很小或为零。

5) 用 2〜3 倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱 Poly(A)ˉRNA，以 1/3〜1/2 柱体积分步收集洗脱液。

6）调整所收集的 KNA 溶液的乙酸钠浓度至 0.3mol/L, 加 2.5 倍体积乙醇，一 20℃放置过夜或干冰/乙醇中 30 min

7) 于 4°C10000 g 离心 15mim 沉淀 RNA。弃去乙醇，再用 70% 乙醇洗沉淀. 弃去 70% 乙醇，晾干沉淀，重溶于少量无 RNA 酶的 TE 缓冲液。取在 70°C 加热 5 min 后，在 1% 琼脂糖凝胶电泳中检査 RNA 的质量。

S)poly(A)+1RNA 溶液可直接于 70℃ 保存，或加 3 倍体积乙醇保存于一 70℃

注意事项        

1 ) l ml 的 oligo(dT)-纤维素最大载样量为 10 mg 总 RNA，如果总 RNA 的量较少，应减少 oligo( (dT)-纤维素量 . 以免 poly( A)ˉ RNA 在过柱和后续步骤中损失。同时也避免浪费。

2 ) 加热 RNA 可以破坏可能的 poly( A)ˉ 尾的二级结构 。

3 ) 从加样的总 RNA 中可回收约 1%〜 2¾ puly(A)ˉ RNA，从 10^7 个哺乳动物细胞中可获得 1〜5ug Poly( A)+RNA。

4) 电泳检测 poly( A)+RNA 应在 20k h 以下并呈弥散状 ，且绝大多数集中在 5〜10kb 范围

5 ) 十二烷基肌氨酸钠较难溶，若室温低于 18℃ 可能会阻碍柱内液体的流动，可用氯化锂代替加样缓冲液中的氯化钠以解决此问题。

来源：丁香通