试剂、试剂盒         

0.lmol LNaOH 乙醇 3mol L 乙酸钠 苯酚 无 SDS 的结合缓冲液 含 SDS 的结合缓冲液 TE 缓冲液 SEVAG 漂白剂（Bleach) 含 MgCl2 的 PBS(pH7.2) 果蝇勻浆缓冲液

实验步骤        

一 材料与设备

 

1)0.lmol/LNaOH

 

2)70%(V/V) 乙醇

 

3)3mol/L 乙酸钠，PH5.2

 

4) 苯酚

 

5) 无 SDS 的结合缓冲液：5 mmol/LEDTA，10 mmol/LTris-HCl（PH7.5)0.4mol/LNaCl

 

6) 含 SDS 的结合缓冲液：0,5%(m/V)SDS,5 mmol/LEDTA，10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)，0.4mol/LNaCI。

 

7)TE 缓冲液 1Ommol/LTris-HCl(pH8.0)，1 mmol/LEDTA.

 

8)SEVAG: 氯仿：异戊醇 (24:1)

 

9) 漂白剂（Bleach):50%(V/V) 家用漂白剂（HouseholdBleach)

 

10) 含 MgCl2 的 PBS(pH7.2):2.7 mmol/LKCl,4.3 mmol/LNa2 HPO4,，1.8 mmol/LKH2PO4,137 mmol/LMaCl 每升溶液加 lgMgCl2

 

11) 果蝇勻浆缓冲液：1%(m/L)SDS，0.15mol/L 乙酸钠，高压灭菌并冷却到室温后加入 PH8.0 的 Tris-HCl 和 EDTA 至终浓度分别为 50 mmol/L，和 5 mmol/L

二 操作方法

 

1. 准备果蝇胚胎

 

(二）操作方法

1) 收集胚胎，用双蒸水漂洗。

 

2) 在 50% 漂白剂中去膜，然后用双蒸水漂洗。

 

3) 把去膜的胚胎放在液氮中速冻。

 

4) 样品可用于提取 RNAt&可以冻存于-60℃

 

5) 融化前将胚胎转移到 50 ml 的管中.

 

2. 总 RNA 的分离

 

1) 在 10 ml 酚和 10 ml 果蝇勻浆缓冲液中勻浆 30s, 以平衡 polytron 匀浆器（以第七档）匀浆。

 

2) 加入约 3 倍体积的果蝇匀浆缓冲液（如：.5 ml 胚胎加 5 ml 缓冲液）及 3 倍体积的酚至冻存的胚胎中。

 

3）用 polytron 匀浆器以 4.5 挡匀浆 3 次，每次 30s. 勻浆液在液氮中速冻几秒至呈半固体。

 

4) 用 8OOml 双蒸水洗涤匀浆器 2〜3 次。

 

5) 加等体积的 SEVAG 至勻浆混合液中，振摇混合。

 

6) 室温以 5000 g 离心 15 min，分层

7) 观察离心的溶液.①如果水相非常少而中间层起泡沫，则用宽吸口的吸头把中间层转移到 50 ml 的管中，加入 1.5 倍体积的SEVAG，振摇混合后以 12000 g 离心 10 min. 保存水相继续下面的操作。②如果中间层只有很少泡沫或没有泡沫，则把水相转移到 1.5 倍体积的 SEVAG 中，振摇混合，以 5000 g 离心 lOmin。保存水相继续下面的操作。

 

8) 继续用 SEVAG 柚提，至中间层没有泡沫。

 

9）在水相中，加入等体积的酚/SEVAG(1:1)，按第 7) 步的方法抽提

 

10) 继续以酚/SEVAG 抽提，直至看不见屮间层。

 

11) 用 SEVAG 抽提水相一两次，保存水相。

 

12) 水相中加入 0.1 体积的 3mol/L 乙酸钠和 2.5 体积的无水乙醇。

 

13) 颠倒混合，-80℃ 沉淀过夜。

 

14) 于 4°C，以 14000 g 离心 15 min

 

15) 去上清，室温干燥约 2 min

 

16) 以适当体积的水溶解 RNA 沉淀 u 如果用下向的方法制 Poly(A)+RNA, 用含 SDS 的结合缓冲液溶解。

 

3. 从总 RNA 中分离 poly(A)+RNA

 

1) 按产品说明书水合 3 型 oligo(dT) 纤维素。

 

2) 用大量含 SDS 的结合缓冲液清冼纤维素。

3) 按下列顺序漂洗柱子：10 倍体积的 0.lmol/LNa()H，10 倍体积含 SDS 的结合缓冲液 A 倍体积的 TE 缓冲液，10 倍体积含 SDS 的结合拳冲液

 

4) 保存 20ul 总 RNA(溶于含 SDS 的结合缓冲液中）于冰上，将剩余的总 RNA 上样到 3 型 digo(dT) 纤维素柱上。

 

5) 收集洗脱液并 fl 过柱两次以上。

 

6）冼脱液于-80℃ 保存。

 

7) 用 10 倍柱体积不含 SDS 的结合缓冲液洗柱

 

8) 用 6 倍柱体积 TE 缓冲液洗脱 poly(A)ˉRNA，在冰上收集洗脱液。

 

9) 洗脱液中加 0.1 倍体积乙酸钠和 2.5 倍体积无水乙醇。

 

10) 样品于 80℃ 过夜。

 

11) 于 4℃，以 14000 g 离心 10 min, 去上清。

 

12) 加入与上清等体积的 70% 乙醇漂洗沉淀。

 

13) 于 4℃. 以 14000 g 离心 10 min，弃上清。

 

14) 用重蒸水溶解沉淀. 分装成适当体积于-80℃ 或 20℃ 保存

注意事项        

1) 纤维索的用量及柱的尺寸是很重要的，每 1 mg 总 RNA 大约需 lml 纤维素树脂。

 

2)3 型 oiigo(dT) 纤维素按下面的方法洗后可保存并可重新利用。先用 10 倍柱体积的 0.lmol/LNaOH 洗柱，再用 10 倍柱体积含 SDS 的结合缓冲液洗柱. 装有含 SDS 结合缓冲液的纤维素柱密封后可于室温保存

来源：丁香通