实验专栏丨三步速学Elisa
发布人：管理员 浏览次数： 发布时间：2017-08-03
Elisa实验的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的灵敏度。
第一步：确定实验方法
1.直接法（direct ELISA）
将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可测定抗原总量，此一级抗体的特异性非常重要。
优点：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。
缺点：试验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。
2.间接法（indirect ELISA）
此测定方法与直接法类似，差别在于一级抗体没有酶标记，改用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。
优点：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。
缺点：交互反应发生的机率较高。
3.双抗体夹心法（sandwich ELISA）
被检测的抗原包被在两个抗体之间，其中一个抗体将抗原固定于固相载体上，即捕捉抗体。另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量；或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体必须小心选取，才可避免交互反应或竞争相同的抗原结合部位。
优点：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。
缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。
4.竞争法（competitive ELISA）
样本里的抗原（自由抗原）和纯化并固定在固相载体上的抗原（固定抗原）一起竞争相同的抗体，当样品里的自由抗原越多，就可以结合越多的抗体，而固定抗原就只能结合到较少的抗体，反之亦然。经清洗步骤，洗去自由抗原和抗体的复合物，只留下固定抗原和抗体的复合物，拿来与只有固定抗原的对照组结果相比较，根据呈色差异就可计算出样品里的抗原含量。
优点：可适用比较不纯的样本，而且数据再现性很高。
缺点：整体的敏感性和专一性都较差。
我们最常用的方法是双抗体夹心法 ，所以今天中洪君就以此为例。
第二步：实验具体步骤
一、双抗体夹心法检测未知抗原时：
1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
二、双抗体夹心法检测未知抗体时：
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗体。 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
第三步：实验注意事项
1.正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
2.在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1)固相载体的选择：许多物质可作为固相载体。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
(2)包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
(3)酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的灵敏度。
第一步：确定实验方法
1.直接法（direct ELISA）
将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可测定抗原总量，此一级抗体的特异性非常重要。
优点：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。
缺点：试验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。
2.间接法（indirect ELISA）
此测定方法与直接法类似，差别在于一级抗体没有酶标记，改用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。
优点：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。
缺点：交互反应发生的机率较高。
3.双抗体夹心法（sandwich ELISA）
被检测的抗原包被在两个抗体之间，其中一个抗体将抗原固定于固相载体上，即捕捉抗体。另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量；或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体必须小心选取，才可避免交互反应或竞争相同的抗原结合部位。
优点：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。
缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。
4.竞争法（competitive ELISA）
样本里的抗原（自由抗原）和纯化并固定在固相载体上的抗原（固定抗原）一起竞争相同的抗体，当样品里的自由抗原越多，就可以结合越多的抗体，而固定抗原就只能结合到较少的抗体，反之亦然。经清洗步骤，洗去自由抗原和抗体的复合物，只留下固定抗原和抗体的复合物，拿来与只有固定抗原的对照组结果相比较，根据呈色差异就可计算出样品里的抗原含量。
优点：可适用比较不纯的样本，而且数据再现性很高。
缺点：整体的敏感性和专一性都较差。
我们最常用的方法是双抗体夹心法 ，所以今天中洪君就以此为例。
第二步：实验具体步骤
一、双抗体夹心法检测未知抗原时：
1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
二、双抗体夹心法检测未知抗体时：
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗体。 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
第三步：实验注意事项
1.正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
2.在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1)固相载体的选择：许多物质可作为固相载体。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
(2)包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
(3)酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4)酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
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