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叶绿体的分离与荧光观察

叶绿体的分离与荧光观察

 

  实验方法原理 组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、密度、离心力及介质黏度等。同一离心场中,同一时间内,密度和大小不同的颗粒沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间,就能使非均一的悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部,从而可分批收集各种亚细胞成分。


  实验材料 新鲜菠菜


  试剂、试剂盒 氯化钠


  仪器、耗材 离心机组织捣碎机显微镜天平离心管纱布烧杯量筒滴管载玻片、盖玻片


  实验步骤


一、实验步骤

 

  1.  选取新鲜的嫩菠菜叶,洗净擦干后去除叶梗及粗脉,称30 g 于150 ml 0.35 mol/L NaCI溶液中,装入组织捣碎机。

 

  2.  利用组织捣碎机低速(5 000 r/min)匀浆3~5 min。

 

  3.  将匀浆用6层纱布过滤于500 ml 烧杯中。

 

  4.  取滤液4 ml 在1 000 r/min 下离心2 min。弃去沉淀。

 

  5.  将上沾液在3 000 r/min下离心5 min。弃去上清液,沉淀即为叶绿体(混有部分细胞陔)。

 

  6.  将沉淀用0.35 mol/L NaCI溶液悬浮。

 

  7.  取叶绿体悬液一消滴于载片上,加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。

 

  (1)在普通光镜下观察。

 

  (2)在荧光显微镜下观察。

 

  (3)取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上,再漓加一滴0.01%吖啶橙荧光染料,加无荧光盖片后即可以荧光显微镜下观察。

 

菠菜叶手切片观察用剖须刀将新鲜的嫩菠菜切削一斜面置于载片上,滴加1~2滴0.35 mol/L NaCI溶液,加盖片后轻压,置显微镜下观察。

 

  (1)在普通光镜下观察。

 

  (2)在荧光显微镜下观察。

 

  (3)用同样方法制片,但滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液染色1 min,洗去余液,加盖廾后即町以荧光显微镜下观察。

 

二、实验结果

 

  1.  叶绿体的分离和观察

 

  (1)普通光镜下,可看到叶绿体为绿色橄榄形,在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒,即基粒。

  

  (2)以Olympus荧光显微镜为例,在选用B(blue)激发滤片,B双色镜和O530(orange)阻断滤片的条件下,叶绿体发出火红色荧光。

 

  (3)加入吖啶橙染色后,叶绿体可发出桔红色荧光,而其中混有的细胞核则发绿色荧色。

  

  2.  菠菜叶手切片观察

 

  (1)在普通光镜下可以看到三种细胞

 

  ①表面细胞:为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。

 

  ②保卫细胞:为构成气孔的成对存在的肾形细胞。

 

  ③叶肉细胞:为排成栅状的长方形和椭幽形细胞。

 

  叶绿体呈绿色橄榄形,在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。

 

  (2)在荧光显微镜下,叶绿体发出火红色荧光,但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光,两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。

 

  (3)用吖啶橙染色后,叶绿体则发出枯红色荧光,细胞核町发出绿色荧光,气孔仍为绿色。


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