1 导论

 

聚合酶链式反应（PCR）以其优越性极大地影响到了分子生物学的几乎所有领域，并以其基本程序和DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis），开发出多种检测核苷酸变异的方法。RAPD（Random Amplifed Polymorphic DNA）就是其中的一种，它是1990年美国杜邦公司科学家J.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所J.Welsh领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新技术。Williams称之为RAPD，Welsh叫它AP-PCR（Arbitrary Primer PCR）（Welsh J et al,Nucl Acids Res,1990(18):7213; Williams J G K et al,Nucl Acids Res,1990(18):6531）。与常规PCR相比，RAPD主要有以下的自身特点：①无需专门设计RAPD扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为9～10个寡核苷酸。②每个RAPD反应中，仅加单个引物，通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。③退火温度较低，一般为36℃，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。④较之常规PCR，RAPD反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量DNA分子标记，可以借助计算机进行系统分析。

 

RAPD作为单引物的PCR扩增产物，其产生机理是引物首先结合到模板链，沿模板5’端方向延伸而产生不同长度的DNA片段，然后以这些片段为模板继续大量扩增。由于RAPD反应中，在3’端没有相应引物和模板互补，这样必然存在一个由引物沿模板DNA 5’端方向延伸后再在3’端形成同一引物互补序列的过程。有人提出，在RAPD反应过程中，扩增可能存在一些这样的分子模式：①5’端带有引物的单链DNA分子在3’端发生折转、自身结合和延伸，并在3’端形成同一引物的互补序列，变性展开后即可成为单引物PCR扩增的模板分子。②通过两条5’端各带同一引物的单链DNA分子拼联来实现。③对基因组DNA分子的颠倒重复序列而言，如果引物的结合位置正好处于这些序列的3’端，那么在其DNA片段的两条单链上就分别具有一个引物的结合位置和它互补的序列，成了RAPD扩增的模板分子。在双引物通用PCR中这种情况很少，但由于RAPD所用引物短，又在低温下退火，这增加了引物和颠倒重复序列结合的机会，完全有可能产生RAPD。

2 试验条件

 

【药品试剂】

 

模板DNA（10～100ng）

 

寡核苷酸引物（20mmol/L贮存液，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司购买，也可以自己合成）

 

0.2 mmol/L dNTPs（必须使用高质量的dNTPs，这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解，因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等）

 

Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer,Norwalk,Connecticut）

 

10×PCR缓冲液（500 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl2 ,100 mmol/L Tris HCl,pH 8.3）

 

矿物油

 

电泳所需试剂

 

【仪器设备】

 

PCR扩增仪

 

电泳装置

 

微量离心机

 

微量移液器（1～20ml和20～200ml）

 

0.5 ml Eppendorf管

 

紫外线观察装置及照相设备

 

3 操作程序

 

1）在冰里向无菌的Eppendorf管中加入以下反应物：

 

水 14.75 ml

10×缓冲液 2 ml

 

10×dNTPs 2 ml

 

引物（20 mmol/L）0.2 ml

 

Taq DNA聚合酶

 

终体积

 

DNA（10～100ng）1 ml

 

石蜡油 20ml

 

（2）93℃反应2 min后开始如下循环：

 

93℃变性反应1min

 

36℃退火反应1min

 

72℃延伸反应1.5min

 

经过45个循环后，最后一个循环72℃增加5min，循环结束后反应产物置于4℃保存。

 

（3）20ml反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况。

 

4 应注意的问题及其解决方法

 

（1）扩增偏差或无扩增。

 

在部分或全部管中缺少一个组分。重复少量几个反应以确定所有的PCR组分是否都已加入。

 

PCR抑制物可能与DNA一起纯化，改变DNA的浓度。

 

在DNA分离中加入一个清洗步骤（如苯酚抽提）。

 

稀释新的DNA溶液。

 

引物母液失效。重新配制母液，使用不同的引物或提高引物浓度。

延长退火时间（在PCR程序中的第二部分），或降低升温转换步骤之间的速率。

 

提高每个反应中的Taq聚合酶的浓度。

 

补加新的组分，该灭菌的都高压灭菌。

 

（2）扩增结果差，条带模糊或难以辨认。

 

更换Taq聚合酶缓冲液。

 

检查引物（使用另外一个引物，或者将引物末端标记，在16% 6mol/L尿素聚丙烯酰胺胶上电泳检测）。

 

检查Taq聚合酶活性（与不同批量的酶作比较）。

 

改变DNA浓度。

 

（3）高相对分子质量产物弥散状分布>4kb。

 

降低DNA浓度。

 

降低Taq聚合酶浓度。

 

减少凝胶上样量。

 

可能是由于循环数过多的结果（Bell和Demarini 1991），减少循环数。

 

确认是否使用正确的缓冲液（不是水！）制备凝胶。

 

在较低的电压下电泳。

 

（4）在对照和所有检测样品中均为一条很强的单一带。

 

确认引物序列不是回文结构。这可能是引物多聚体造成的结果。使用不同的引物。

 

（5）带谱不可重复。

 

DNA过多或过少。把基因组DNA浓度控制在10～100ng范围之内，DNA量太少时，“真正”靶序列与引物的结合效率低，因此引物扩增会产生假的条带，这就称为引物伪迹；DNA量太多会导致错误配对（指引物与基因组DNA的配对）。每个样品进行两个不同DNA浓度的反应。

只考虑主要条带。

 

（6）染色后凝胶背景太强影响分辨率。

 

减少染色时间。

 

凝胶脱色时间延长。

 

PCR反应中DNA含量或Taq聚合酶过多。

 

（7）低相对分子质量产物分离不充分。

 

在更高浓度的琼脂糖凝胶、专业纯凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上分离产物。

 

5 RAPD分析的优越性和不足

 

RAPD是一种全新且有效的遗传标记，与其他分子标记相比，具有许多优越之处：①合成一套引物，可用于不同生物基因组的分析。相对来说，RFLP标记具种族特异性，这限制了其应用。②RAPD技术简便易行，省力省时。不需要RFLP分析的预备工作，如克隆制备、同位素标记、Southern印迹和分子杂交。并且RAPD检测灵敏方便，用荧光染料或同位素标记均可检测，这大大增加了其分析速度。即使用序列胶来分析RAPD，单独一人仅用36小时便能完成120个样品的分析，而RFLP至少要花一周时间。③RAPD分析所需样品DNA量极少。仅为RFLP的1/1000～1/200，这对于生物早期取样鉴定或DNA受限制的情况大有益处。④由于RAPD用于构建基因图谱时不需要克隆，这可打破克隆载体和宿主的限制，扩大了应用范围。⑤每个RAPD标记相当于基因组分析中的靶序列位点，这对共同协作的研究项目，可简化信息的转移过程。⑥RAPD标记可以对那些RFLP难以区分的基因组区域作出遗传连锁图。⑦RAPD分析能自动化，减少了象RFLP那样的麻烦手续。

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