质粒克隆操作最费时间的步骤是用电泳的方法对预期大小的外源 DNA 片段和质粒 DNA 片段进行纯化，在以下的方案中（取自Struhl 1985)，质粒和外源 DNA 的连接可在低熔点球脂糖存在的条件下完成。

实验方法原理         

质粒克隆操作最费时间的步骤是用电泳的方法对预期大小的外源 DNA 片段和质粒 DNA 片段进行纯化，在以下的方案中（取自Struhl 1985)，质粒和外源 DNA 的连接可在低熔点球脂糖存在的条件下完成。

实验材料         

限制性内切核酸酶外源 DNA 片段质粒 DNA

试剂、试剂盒       

  

Tris-ClMgCl2DTTATPT4 噬菌体 DNA 连接酶

仪器、耗材     

低熔点琼脂糖凝胶恒温板手提式长波紫外灯水浴

实验步骤     

   

一、材料

 

1. 酶和缓冲液

 

(1) 2X T4 噬菌体 DNA 连接酶反应混合物：

 

1 mol/L Tris-Cl ( pH 7.6 ) 1.0 μl，100 mmol/L MgCl2 2.0 μl，200 mmol/L DTT 1.0 μl，10 mmol/L ATP 1.0 μl，H2O 4.5 μl，T4 噬菌体 DNA 连接酶 1.0 Weiss 单位。

 

每个连接反应需 10 μl 体系。

 

每次应用前需新鲜配制，装于微量离心管中在冰中预冷，将反应混合物置于冰上备用。

 

(2) 限制性内切核酸酶

 

2. 凝胶

 

低熔点琼脂糖凝胶

3. 核酸和寡核苷酸

 

外源 DNA 片段，质粒 DNA ( ~100 μg/ml，经去磷酸化处理）

 

每次连接反应大约需要 100 ng 去磷酸化的 DNA。

 

4. 专用设备

 

可设置 70℃ 的恒温板，手提式长波紫外灯（302nm），可设置 16℃ 的水浴。

 

二、方法

 

1. 建立一个酶切反应体系（不超过 20 μl），用适当的限制酶消化一定量的靶 DNA，要求最后能获得 250 ng 的目的片段。

 

2. 用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段。

 

3. 长波紫外灯下检査凝胶中 DNA 的电泳情况，根据条带的荧光强度估计 DNA 的量，用洁净的手术刀片切下目的条带，尽可能少切琼脂糖（一般约为 40~50 μl）。各目的条带都留下少许在凝胶中不要切，用于照相中表示各条带在凝胶电泳中的位置。

 

4. 将切下的凝胶片分别装入已做好标记的微量离心管中。

 

也可以将切下的凝胶片装在密封的微量离心管中于 4℃ 保存几天。

 

5. 离心管置于 70℃ 恒温块 15 min 以熔化凝胶条，确定离心管中凝胶的体积并计算含有约 200 ng DNA 所需的体积。

 

这样做的目的是用 10 μl 或更小的体积收取 200 ng 量的 DNA。这要取决于实际情况。对于含量低于 10 的条带（在凝胶中刚好可见)，连接仍可进行，尽管连接效率较低。

6. 预热一个无菌的微量离心管至 37℃ 立即加入下列成分：

 

去磷酸化质粒 DNA 60 fmol，外源 DNA 片段 120~240 fmol（不超过 10 μl 体积）。

 

用一个无菌一次性吸头快速混匀上述混合物，避免琼脂糖凝胶凝固。

 

在连接反应中，外源 DNA 片段与质粒载体的摩尔比一般在 2：1~4：1 之间。

 

7. 给每一个反应管相应地做两个对照，一个只加去磷酸化质粒载体，另一个只加外源 DNA 片段。

 

8. 上述的反应管置于 37℃ 温育 5~10 min，而后每管加入现冷的 10 μl 2X T4 噬菌体连接酶反应混合物。用一个无菌一次性吸头快速混匀上述混合物，避免琼脂糖凝胶凝固。16℃  温育 12~16 h。

 

上述的连接产物可直接用于转化大肠杆菌或电泳。在做转化或电穿孔转化之前，装连接产物的微量离心管需预先于 70℃ 加热 10~15 min 以重新熔解已凝固的凝胶。

 

习惯上，1~5 μl 连接产物可以用来转化化学方法制备的感受态细胞、而用更为有效的电穿孔转化法则只需 0.1~1.0 μl 的连接产物。采用更大体积进行电穿孔转化会增加溶质的浓度，以至使弧光的发生难以预测。

此文转载来源：丁香通